زرع الرئة المعدلة بيولوجيا باستخدام رئتي الفئران منزوعة الخلايا والخلايا البطانية البشرية الأولية

تتطلب الهندسة الحيوية الأعضاء بحجم الإنسان قدرا كبيرا من الموارد ، والتي غالبا ما تتجاوز قدرة المختبرات الأكاديمية. سيؤدي تقليل تكلفة تطوير البروتوكول التكراري إلى تسريع تقدم البحث في هذا المجال. الهدف من هذه الدراسة هو توفير بروتوكول موحد للهندسة الحيوية للرئة باستخدام كتل القلب والرئة للفأر. لا يزال من غير المعروف ما هي الخلايا المناسبة للهندسة الحيوية للأعضاء ، وكيف يجب دمج هذه الخلايا في ثقافة المفاعل الحيوي للأعضاء. يجب مقارنة أنواع متعددة من الخلايا والظروف من أجل إنشاء بروتوكولات قابلة للتطوير وقابلة للتكرار.

الفئران تجريبية صغيرة وسهلة التعامل معها. ومع ذلك ، على الرغم من صغر حجمها ، إلا أن البنية الأساسية للرئة متشابهة عبر الثدييات. من خلال تحسين البروتوكول على هذه المنصة الصغيرة ، يمكننا توسيع نطاق نماذج الليزر ببساطة عن طريق مضاعفة النتائج المحسنة وفقا لحجم. تسمح منصة الهندسة الحيوية للرئة بحجم الفأر للباحثين باختبار خلاياهم الجذعية بكفاءة. يمكن أن تكون هذه الخلايا المعدلة وراثيا ثمينة أو باهظة الثمن لاستخدامها في هندسة الرئة بأكملها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام الخلايا المشتقة من المريض لإنشاء نماذج المرض في المختبر.

تتضمن الجهود الحالية اختبار أنواع متعددة من الخلايا الجذعية المهندسة والخلايا السلفية ، لمعرفة إمكانات الانتشار المطلوبة ، والقدرة التفاضلية للهندسة الحيوية للرئة. بمجرد تحديد الخلايا المناسبة ، سيتم توسيع هذا البحث ليشمل نموذجا حيوانيا أكبر مثل الخنازير.

[الراوي] للبدء ، ضع الفأر القتل الرحيم في وضع ضعيف على طاولة جراحية ، وقم بإصلاح الأطراف. رش 70٪ من الإيثانول بالتساوي على سطح الصدر والبطن لتعقيمه. بعد ذلك ، افتح تجويف البطن على طول الخط المتوسط الممتد إلى الرقبة ، باستخدام مقص غير قابل للصدأ ، وقم بتقسيم القص. استئصال الحجاب الحاجز من الجدار الصدري. قطع جدار الصدر البطني لكشف تجاويف الصدر وإزالة الغدة الصعترية. باستخدام خياطة حريرية 4/0 ، قم بتفويض الوريد الأجوف السفلي والوريد الأجوف العلوي الأيمن. قطع الشريان الأورطي البطني بمقص غير قابل للصدأ للتصريف. باستخدام حقنة معقمة سعة خمسة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 27 ، قم بحقن ثلاثة ملليلتر من PBS المعقم في البطين الأيمن عن طريق ثقب جدار البطين. استخدم ملقط دومون للف خياطة حريرية 4/0 حول الشريان الرئوي الرئيسي. بعد ذلك ، قم بقطع نافذة بحجم ملليمترين أسفل صمامات الشريان الرئوي ، باستخدام مقص زنبركي ، للوصول إلى جدار البطين الأيمن. أدخل قسطرة الشريان الرئوي من خلال النافذة ، وثبتها بخيطة الحرير 4/0 الحلقية مسبقا. حقن ملليلترين من PBS ببطء من خلال قسطرة الشريان الرئوي باستخدام حقنة سعة خمسة ملليلتر. قم بتقنيد القصبة الهوائية بقسطرة القصبة الهوائية ، واربطها في مكانها بخياطة حريرية 4/0. الآن ، قم بحقن ملليلترين من الهواء ببطء من خلال قسطرة القصبة الهوائية باستخدام حقنة فارغة سعة خمسة ملليلتر. احتفظ بالهواء لمدة 10 ثوان لضمان عدم تسرب الهواء من الرئتين. قم بإزالة إحصار نهاية القلب والرئتين. بعد ذلك ، انقل كتلة القلب والرئة المقطوعة إلى طبق بتري بلاستيكي بقطر 10 سم يحتوي على ماء منزوع الأيونات ، لإزالة الخلايا من الرئتين. احتضان الكتلة لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، باستخدام حقنة سعة خمسة ملليلتر ، قم بحقن ملليلترين من الماء المعقم منزوع الأيونات من خلال قسطرة القصبة الهوائية ثلاث مرات. توقف مؤقتا بعد كل حقنة للسماح للسائل بالخروج مع ارتداد الرئتين. وبالمثل ، قم بحقن ملليلترين من الماء من خلال قسطرة الشريان الرئوي. حقن ملليلترين من محلول Triton X-100 0.1٪ في كل من قسطرة الشريان الرئوي والقصبة الهوائية. انقل كتلة القلب والرئة إلى طبق بتري ، واحتضانها بشكل ثابت في محلول Triton X-100 طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، لإزالة محلول Triton X-100 من الرئتين ، قم بحقن ملليلترين من الماء منزوع الأيونات في قسطرة القصبة الهوائية وقسطرة الشريان الرئوي ، وكرر ذلك مع ملليلترين من محلول ديوكسي كولات 2٪. بعد إزالة محلول الديوكسي كولات من الرئتين ، قم بحقن ملليلترين من محلول كلوريد الصوديوم المولي في كل من القسطرة القصبية والشريان الرئوي. احتضان كتلة القلب والرئة لمدة ساعة واحدة. بعد إزالة محلول كلوريد الصوديوم بالماء منزوع الأيونات ، قم بحقن ملليلترين من محلول عمل DNase I في قسطرة القصبة الهوائية والشريان الرئوي. احتضان كتلة القلب والرئة لمدة ساعة واحدة. حقن PBS معقم في قسطرة الشريان الرغامي والشريان الرئوي لإزالة محلول DNase I. بعد إزالة الخلايا ، تأكد من أن الرئتين بيضاء وشفافة عند الحواف. أضف 70 مل من وسط نمو الخلايا البطانية 2 ، أو وسائط زراعة EGM-2 ، إلى العلبة الزجاجية ، وضع سدادة السيليكون فوق العلبة لإغلاقها. قم بتجميع سدادة من السيليكون ، وعلبة زجاجية ، وغطاء لولبي GL45 مع أنابيب ، وزجاجة زجاجية قابلة للتعقيم سعة 250 مليلتر ، وأنابيب L / S 14 مع تركيبات إغراء باستخدام محبس ثلاثي الاتجاهات. أدخل إبرة قياس 20 في حاجز السيليكون للغطاء اللولبي GL45. املأ الأنابيب A و B و C بوسائط الاستزراع باستخدام حقنة سعة 10 ملليلتر متصلة بمحبس واحد وثلاثة. قم بتوصيل قسطرة الشريان الرئوي لإحصار القلب والرئة منزوعة الخلايا بالأنبوب C عن طريق تركيب إغراء. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في القسطرة أو الأنبوب. للحقن المدفوع بالجاذبية للخلايا البطانية ، ضع خزانا للخلية يحتوي على خلايا بطانة الوريد السري البشري ، أو HUVECs ، على محرك مغناطيسي ، مع التأكد من أن الخزان على ارتفاع 30 سم فوق حجرة الأعضاء. قم بتشغيل النمام المغناطيسي بسرعة 120 دورة في الدقيقة. افتح محبس واحد واثنين للسماح لتعليق الخلية بالتدفق إلى السقالة منزوعة الخلايا ، عبر الأنبوب A والأنبوب C وقسطرة الشريان الرئوي. من أجل نضح ثقافة الأعضاء ، ضع حجرة الأعضاء في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. قم بتوصيل الأنبوب B برأس مضخة متصل بمضخة نابضة. أغلق باب زجاج الحاضنة. تأكد من وضع الأنبوب بشكل صحيح بين الباب والختم المطاطي. احتضان السقالة منزوعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات للسماح للخلايا البطانية بالاستقرار داخل السقالة. ابدأ تشغيل المضخة بمعدل ستة دورة في الدقيقة ، مما ينتج عنه نضح وسائط ملليلتر في الدقيقة باستخدام أنبوب L / S 14. لاحظ أن الرئة منزوعة الخلايا تتوسع قليلا بسبب تروية الوسائط. ثم أغلق باب الحاضنة. لإجراء تغيير الوسائط، أوقف محرك المضخة. قم بتوصيل حقنة معقمة سعة 50 مليلتر بمحبس ثلاثة ، واسحب 50 مل من الوسائط من الغرفة. املأ حقنة معقمة أخرى سعة 50 ملليلتر ب 50 مل من الوسائط الدافئة مسبقا. قم بحقن المحلول في علبة زجاجية ، وانقل الوسائط إلى الغرفة عبر محبس ثلاثة ، مما يضمن تبديل محبس الملف بشكل مناسب. أعد تشغيل المضخة النابضة. احصد كتلة القلب والرئة المعاد تكليفها بعد يومين من زراعة أعضاء التروية. ظهرت رئتا الفئران بيضاء وشفافة بعد إزالة الخلايا ، مما يشير إلى إزالة المكونات الخلوية ، مع الحفاظ على بنية الرئة العامة. كشف التحليل النسيجي لرئتي الفأر منزوعة الخلايا عن هياكل سنخية سليمة ، مع عدم وجود مكونات خلوية متبقية. أظهرت رئتا الفئران المعاد خليتها بثلاثة أضعاف 10 إلى قوة سبعة HUVECs بعد يومين من زراعة المفاعل الحيوي القائم على التروية ، توزيعا متجانسا ل HUVECs. هاجرت HUVECs إلى المناطق السنخية الطرفية ، وشكلت شبكة شبيهة بالشعريات ، كما لوحظ في الرئتين المكسورة.