تحضير العينات الآلي للتحليل متعدد الخلية لتعديلات ما بعد الترجمة على الهيستون أحادي الخلية (sc-hPTM2)

نحن نطور بروتيوميكس الخلية الواحدة باستخدام طريقة متعددة الخلايا آلية لدراسة التغاير العالمي للكروماتين لإجراء تعديلات ما بعد الترجمة. ما يجعل هذا البروتوكول تحديا هو تحضير البروتين على مقياس البيكوغرام، ووضع العلامات المتعددة، بالإضافة إلى حل الببتيدات الهيستونية المعدلة التركيبية المعقدة. للبدء، أعد بناء خلايا سرطان الخلايا الكبدية لفيروس التهاب الكبد G2/C3A بتركيز نهائي يتراوح بين 200 إلى 500 خلية لكل ميكرولتر في PBS البارد جدا.

اضبط عرض نبضة كل فوهة وجهد المحرك على القيم التي يوفرها المصنع. لتحقيق أقصى كفاءة في الالتقاط، تأكد من أن انحراف Z بين الفوهتين يختلف بأقل من 50 ميكرومتر. حدد الموضع الأمثل للاتصال لكل فوهة وقارن قراءات ارتفاع Z في تبويب إعداد الفوهة.

في نظام التوصيل المتعدد في التوبلكس، قم بتحميل شريحة واحدة على حامل الشريحة في غطاء المحرك ثم انقلها إلى الآلة. باستخدام ماصة، أدخل 150 ميكرولتر من DMSO بدرجة LCMS في أنبوب PCR جديد. ضعه في الموضع الثاني من محطة الغسيل مع غطاء الأنبوب المواجه لباب العدادات.

ابدأ جولة DMSO. احصل على إسقاط مستقر مرة واحدة بعد استنشاق DMSO. لاحظ التغيير في شفافية PDC.

قد يكون من الضروري زيادة الجهد. تحقق من الاستقرار بإجراء فحص انخفاض في مستوى الصوت. قم بإعداد معالج كاميرا الرأس لمحاذاة الكاميرا.

قم بتوزيع DMSO ودع الجهاز يغسل الفوهات تلقائيا والتقاط الصور عبر جميع الشرائح للتحكم في الجودة. راجع هذه الصور للتحقق من وجود قطرة DMSO موحدة على كل شريحة وللتحقق من وجود قطرات مفقودة أو غير مستهدفة. بعد شفط تعليق الخلية، افتح الخلية في وحدة واحدة، وقم بالتقاط الخلفية ثم شغل روتين التعيين لتحديد منطقة القذف.

قم بإجراء التحليل ثم تقوم ببوابة الجسيمات لاختيار الخلايا بناء على الحجم والاستمداد. الآن، حضر خليط هضم جديد في ماء بدرجة LCMS. قم بإزالة الغاز من المحلول بمضخة تفريغ لمدة 10 دقائق على الثلج.

بعد توزيع خليط الهضم على الشرائح، دع الجهاز يقوم تلقائيا بغسل الفوهات والتقاط صور لكل شريحة. راجع الصور للتأكد من أن كل قطرة تتلقى خليط الهضم بشكل متساو. حضن الشرائح في درجة حرارة الغرفة طوال الليل لإجراء عملية الهضم.

بعد بدء عملية التبخر والهضم طوال الليل، افحص الصور. إذا كانت القطرات جافة بما فيه الكفاية، أوقف الجري. إذا لم يكن كذلك، اضغط على الاستمرار وجف لمدة خمس دقائق أخرى.

للوسم، أولا، حضر حلول مخزون لاشتقاق الهيستون متعدد الإرسال. بعد التوزيع، دع الجهاز يغسل الفوهات تلقائيا والتقاط صورة لكل شريحة. راجع الصور لتأكيد التوزيع المتساوي ووضع القطرات الصحيح عبر جميع الشرائح.

بعد انتهاء الحضانة، يتم صرف محلول الهيدروكسي أمين للتبريد. لالتقاط العينة، اختر الجولة في التبويب الرئيسي، ثم ابدأ الجولة في تبويب التشغيل. بعد الانتهاء من عملية الالتقط، راجع الصور للتحقق من أي أخطاء.

بعد الانتهاء من الالتقاط، أزل الغطاء من لوحة الالتقاط. ثم جفف العينات على حرارة منخفضة في جهاز تركيز فراغي. لجمع البيانات، برمج طريقة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء.

اضبط تجربة MS 2 لتحتوي على نوافذ عزل بشحن زائد 50، وتفكك تصادم عالي الطاقة بنسبة 27٪، وهدف التحكم التلقائي في الكسب بنسبة 1000٪. غط اللوح بسجادة مطاطية ووضعها داخل جهاز الأخذ التلقائي. بعد الحصول على الملفات الخام، تحقق بسرعة من الكروماتوجرام ثم قم بتشغيل البيانات الخام في EpiProfile الإصدار 2.1. راجع جدول المخرجات لوفرات PTM الهيستونية المطبعة واستخدمه للتحليلات اللاحقة.

تم قياس أول 20 بيبتيدوفورم هيستوني H3، مما أظهر وفرة نسبية في ظروف السيطرة وبيوتيرات الصوديوم المعالجة. أظهرت كل من أسيتلة H3 K9 وأسيتلة H3 K 14 وفرة نسبية أعلى عند معالجة بيوتيرات الصوديوم. بينما ظهرت أسيتلة K9 في H3، بدا أن أسيتلة K14 أكثر إثراء في الخلايا المعالجة.

ارتفعت مستويات الأسيتلة الكلية بعد معالجة بيوتيرات الصوديوم مع الخلايا المعالجة التي أظهرت توزيع أخطاء أوسع مقارنة بالضوابط مما يعكس التباين الأعلى الذي تم تسجيله على مستوى الخلية الواحدة. أظهر قياس تعديلات الهيستون الفردية والمتزامنة أن حالات الأسيتلة التوافقية كانت الأكثر تأثرا ببيوتيرات الصوديوم. أشار التشتت الأوسع لخلايا بيوتيرات الصوديوم المعالجة إلى زيادة التغاير البيولوجي بين الخلايا الفردية داخل الكرويدات.

يسد هذا البروتوكول الفجوة في البحث فوق الجيني من خلال السماح للعلماء بدراسة حالات الكروماتين عند محلول خلية واحدة. يتيح هذا السير من إعداد عينات عالية الإنتاجية، وتعدد العينات، وتحليل الكتلة غير المتحيز، لإنتاج بيانات فوق جينية حساسة وكمية لخلية واحدة. ستستكشف الأبحاث المستقبلية كيف يغير تنظيم الكروماتين حالات الأمراض مثل السرطان، وأمراض الأيض، والشيخوخة.