سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني للأنسجة السميكة موضح في حصين الفئران

يركز بحثي على إنشاء سير عمل موحد للتجميد والتبريد لتمكين التحليل البنيوي الميداني للأنسجة السميكة مثل حصين الفأر. تفتقر الطرق الحالية إلى الموثوقية للأنسجة السميكة، لذا يدمج هذا البروتوكول خطوات محسنة للتحليل الموحد. للبدء، ضع قطرة بحجم 10 لتر من محلول السكروز بنسبة 10٪ على سطح زجاجي نظيف.

قم بتفكيك الحصين بسرعة من فأر تم إعدامه حديثا. باستخدام شفرة حلاقة حادة، قم بإزالة قطع صغيرة من الأنسجة بحجم 0.5 إلى 1 مليمتر مكعب. باستخدام عود أسنان أو فرشاة دقيقة، انقل النسيج إلى شبكات دعم النحاس المحضرة داخل حامل التجميد عالي الضغط.

استخدم 2-ميثيلبنتان للحفاظ على رطوبة النسيج وضبط موقعه على الشبكة، مع تقليل الإجهاد الميكانيكي لتجنب تلف الشبكة. ثم غط النسيج والشبكة بقرص من رقائق النحاس بقطر 3 ملم فقط. لإكمال التجميع، ضع حامل التجميد الثاني عالي الضغط، مسطحا للأسفل، في الأعلى لتشكيل شطيرة وافل مغلقة.

وتحقق من معايير التجميد للتأكد من عدم وجود خلل في الآلة. تأكد من أن الوقت الإجمالي من تشريح الأنسجة حتى التجميد لا يتجاوز 90 ثانية. احصل على شبكة ذهبية جديدة ب 300 شبكة لتكون شبكة المستقبل النهائية لإجراء الإخراج.

تحت ميكروسكوب ستيريو في درجة حرارة الغرفة، قم بتثبيت الشبكة بلطف في حلقة أوتوجريد متوافقة مع التجميد مع FIB. ثم خزن الأوتوغرايد المجمع مباشرة في فرن جاف، مع الحفاظ على درجة حرارة تقارب 40 درجة مئوية، لتقليل تراكم الصقيع قبل الاستخدام. أثناء غمر المجموعة باستمرار في النيتروجين السائل، افصل بعناية شبكة TEM المزجاجة عن مكونات تجميع الوافل المحيطة.

باستخدام ملقط بارد مسبقا ذو رؤوس دقيقة، افصل بين حاملين للتجميد عالي الضغط برفق. بعد ذلك، على محطة عمل باردة مسبقا وتحميلها بالتبريد، قم بتركيب شبكة الأنسجة المعزولة في حلقة أوتوغريد ثانية من نوع التجميد التلقائي تحت حماية النيتروجين السائل. قم بتحميل كلا الشبكات التلقائية في الفتحات المخصصة لحاملة عينات النقل بالتجميد.

وجه كل أوتوجريد بحيث يكون شق التفريز متجها للخارج وموضوعا عموديا لتمكين زاوية تشكيل أقل. حافظ على المكوك المحمل بالكامل مغمورا في النيتروجين السائل أو محفوظا في حالة مبردة مسبقا حتى يتم نقله إلى FIB-SEM. قم بتحميل مرحلة العينة في الآلة باستخدام قضيب العينة.

بعد النقل بالتجميد إلى المجهر، انتقل إلى شبكة الأنسجة بتكبير SEM منخفض. ثم قم بتغطية سطح الشبكة بالبلاتين عند 30 مللي أمبير لمدة 15 ثانية لتوفير حماية موصلية. وضع غطاء بلاتيني عضوي معدني بسماكة 0.5 إلى 1.0 ميكرومتر باستخدام نظام حقن الغاز لمدة تقارب 60 ثانية.

ضع طبقة بلاتينية مطلية بالرشاشات النهائية على سطح الشبكة عند 30 ملي أمبير لمدة 15 ثانية. باستخدام صورة شعاع الإلكترونات SEM، انتقل إلى المنطقة المختارة على شبكة الأنسجة. لتوجيه العينة للطحن من الجانب الأمامي، قم بضبط المرحلة إلى دوران حوالي 110 درجات وإمالة 7 درجات لعرض سطح العينة بزاوية مناسبة للوصول إلى شعاع الأيونات.

لتشكيل الخندق، حدد خندقا مستطيلا يحيط بكتلة الأنسجة المستهدفة باستخدام شعاع الأيونات الذي يعمل بجهد 30 كيلوفولت. ابدأ الطحن على مسافة من الكتلة باستخدام تيار مرتفع نسبيا قدره 15 نانو أمبير لتحقيق إزالة سريعة للمواد. عندما تقترب جدران الخندق من الكتلة حتى بضعة ميكرومترات، قلل تيار شعاع الأيون إلى 7 نانوأمبير لتحقيق تحكم أكثر دقة في الطحن.

اترك جانبا من الكتلة ملتصقا بالمادة السائبة لتشكيل لسان احتجاز مؤقت. بالنسبة لكتل الأنسجة التي يقدر بسماكتها أكثر من 20 ميكرومتر، قم بتنفيذ خطوة طحن تحت القطع من الجانب الخلفي لتسهيل الرفع النهائي. قم بتدوير المسرح وضبط الميل للوصول إلى أسفل البلوك.

قم بتشكيل الاتصال السفلي باستخدام شعاع الأيونات المركز بقوة 30 كيلوفولت وتيار 3 نانوأمبير. قم بطحن أسفل الكتلة المعدنية ليتناسب بإحكام مع كتلة العينة. قم بطحن سطح التلامس الدقيق بين العينة وكتلة الذهب لجعل التلامس أكثر إحكاما.

لتثبيت العينة على الإبرة، تأكد من أن كتلة الذهب على اتصال مباشر مع العينة المستهدفة. باستخدام شعاع الأيون المركز عند 30 كيلوفولت و0.5 نانوأمبير، قم بتنفيذ 8 إلى 12 نمط طحن مقطع عرضي متتابع عند الواجهة لربط كتلة الذهب بالعينة. لرفع كتلة الأنسجة، اقطع اللسان المتبقي الذي يربط الكتلة بالعينة الكبيرة باستخدام شعاع الأيونات المركز.

حرك إبرة الميكرو بحذر لرفع كتلة الأنسجة المعزولة بعيدا تماما عن الخندق والشبكة المحيطة. اسحب الإبرة وانقل الكتلة إلى شبكة المستقبل. وجه إبرة الميكرو مانبوليتور إلى شبكة استقبال ذهبية مكونة من 300 شبكة مبردة مسبقا.

خفض الكتلة إلى مربع شبكة مختار. قم بإزالة بلورات الجليد الصغيرة على الشبكة لجعل كتلة الأنسجة والشبكة تلتصق بإحكام أكبر. خفض كتلة النسيج بحيث تلامس الشبكة فقط.

قم بطحن شريحة بسماكة 3 إلى 4 ميكرومتر من الكتلة إلى الفيلم الشبكي باستخدام شعاع الأيون. بعد ذلك، لحام الشريحة بإحكام عن طريق الطحن، باستخدام أنماط مقطع التنظيف على جانبي الوصلة، وأعد تطبيق الطلاء الموصل والواقي على سطح الشبكة كما هو موضح سابقا. بالنسبة لتخفيف الصفيحة، بعد ضبط ميل المسرح، حدد الموضع النهائي لللاميلا ضمن منطقة ناعمة من كتلة الأنسجة.

قم بإجراء طحن منهجي باستخدام تيارات شعاع الأيونات وتعويضات الإمالة الزائدة المحددة في الجدول المعروض. عندما تكون على بعد 1 إلى 2 ميكرومتر من الصفائح، يمكنك طحن خندق تخفيف الإجهاد على بعد حوالي 1.5 ميكرومتر لمنع انحناء أو انحناء الصفائح. بعد تحضير الصفيحة اللاميلية، يلتقط صورا باستخدام المجهر الإلكتروني البارد.

أظهرت كتل الأنسجة التي تمت معالجتها بالتجميد عالي الضغط بطريقة الوافل مظهرا موحدا وشفافا للإلكترون. تم حل التصوير المقطعي المعاد بناؤه الهياكل الميتوكوندرية داخل البيئة الخلوية. تم حل المركبات الجزيئية الكبيرة، مثل الريبوسومات، بوضوح في السيتوبلازم.

كما ظهرت الخصائص الخلوية الهيكلية والمرتبطة بالغشاء ومجمعات المسام النووية في التصوير المقطعي المعاد بناؤه. تم رؤية البنى والخصائص المشبكية، بما في ذلك مخزون الكالسيوم وهياكل غمد الميالين، بوضوح في التصوير الطوغرامي. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة البنية الخلوية الخارجية الأصلية مباشرة داخل بيئات الأنسجة المعقدة.

التحدي الأهم في هذا البروتوكول هو تحقيق تزجيج موحد وخالي من الآثار لعينات الأنسجة السميكة. وبعد هذا الإجراء، يمكن للباحثين تحديد المناطق ذات الاهتمام باستخدام تقنيات المجهر المرتبط بالضوء والإلكترونيات أو الوسم، ثم إجراء المتوسط تحت المخطط المقطعي وتحليل البنية لحل المجمعات الجزيئية الكبيرة.