وحيد الخلية في الجسم الحي Electroporation داخل الدماغ سليمة النامية

يُعد التثقيب الكهربائي للخلية المفردة تقنية متخصصة تسمح بإدخال DNA أو الجزيئات الكبيرة الأخرى إلى خلايا فردية ضمن نسيج سليم، بما في ذلك التحضيرات داخل الجسم الحي عند دمجها مع تقنيات التصوير المتقدمة داخل الجسم الحي. ويسمح التثقيب الكهربائي للخلية المفردة باستخدام العلامات الفلورية بالتصور المباشر لمورفولوجيا الخلايا، ونمو الخلايا، والأحداث البينية بين الخلايا على فترات زمنية تتراوح من ثوانٍ إلى أيام. وفي هذا الفيديو، شرحنا بالتفصيل إجراء التثقيب الكهربائي للخلية المفردة لإدخال صبغة فلورية أو DNA بلازميدي إلى العصبونات داخل الدماغ السليم لشرغوف XUS، ونعرض أمثلة للتصوير الحي للعصبونات الموصومة فلورياً.

أهلاً بك. اسمي إيث ها، وأعمل في مختبر الدكتور كورت هاس في مركز أبحاث الدماغ بجامعة كولومبيا البريطانية. سأوضح لكم اليوم كيفية إجراء عملية التثقيب الكهربائي المستهدف لخلية واحدة من العصبونات داخل الدماغ السليم لشرغوف albino XUS Lavis.

تكمن الميزة البارزة لهذه التقنية في إمكانية إجراء التلاعبات التجريبية على خلايا فردية مع ترك الأنسجة المحيطة دون تغيير، مما يسمح بالتمييز بين التأثيرات ذاتية الخلية وتلك الناتجة عن المعالجات الشاملة. تتضمن الخطوة الأولى تصنيع الماصات الدقيقة بقطر طرف وزاوية ميل مناسبين، يليه تحميل مادة النقل في الماصة الدقيقة. بعد ذلك، يجب تخدير تجمعات TA ونقلها إلى غرفة التثبيت، ثم إدخال الماصة الدقيقة في الدماغ وتطبيق سلسلة من نبضات الجهد الكهربائي.

وأخيراً، يتم تصوير العصبونات المحددة باستخدام مجهر الفوتونين. سيتم عرض هذه التقنية لكم في شرغوفات. ويمكن استخدام التحديد أحادي الخلية في أنظمة نموذجية أخرى وكذلك في التحضيرات خارج الجسم (ex vivo).

ومع وضع ذلك في الاعتبار، فلنبدأ. يستهدف التثقيب الكهربائي للخلية الواحدة خلية فردية باستخدام قطب كهربائي عبارة عن ماصة زجاجية دقيقة مسحوبة، والتي تعمل على حصر المجال الكهربائي في خلية واحدة ملامسة لطرف الماصة. وتعد الهندسة الفيزيائية لطرف الماصة ميزة بالغة الأهمية تؤثر بشكل مباشر على نجاح التقنية.

يُستخدم جهاز سحب الأنابيب من طراز Solder model P 97 لتصنيع ماصات دقيقة من زجاج البوروسيليكات بقطر خارجي يبلغ 1.5 millimeters وقطر داخلي يبلغ 0.75 millimeters، وتحتوي على فتيلة داخلية لتسهيل ملء الطرف دون وجود فقاعات هوائية. وقد وُجد أن أطراف الماصات الأكثر فاعلية لعملية التثقيب الكهربائي للخلية الواحدة هي تلك التي يتراوح قطر طرفها بين 0.5 و1 micron وبزوايا استدقاق تزيد عن 10 degrees. وبعد سحب الماصة الزجاجية الدقيقة، يمكن تحميل المادة المراد نقلها والمذابة في محلول داخل الماصة عن طريق الملء العكسي أو باستخدام حقنة تحميل.

في هذا العرض التوضيحي، سنقوم بوضع علامات فلورية على عصبونات مفردة باستخدام صبغة فلورية تظهر هنا أو باستخدام بلازميد يشفر لبروتين GFP الفلوري الأخضر. يجب إجراء طرد مركزي قصير للمحاليل بسرعة عالية لتقليل كمية الحطام الجسيمي الذي قد يدخل إلى الماصة. وبما أن هذا سيزيد من احتمالات انسداد الطرف بالنسبة للمستخدمين الجدد، فمن المستحسن البدء باستخدام الأصباغ الفلورية لأنها يمكن رؤيتها بسهولة تحت مجهر الفلورة العلوية (epi-fluorescence).

يتيح ذلك رؤية الطرف داخل العينة ويوفر تغذية راجعة مباشرة حول ما إذا كانت المعدات قد تم إعدادها بشكل صحيح وما إذا كان طرف الماصة مناسباً. عمل جيد. والآن بعد أن قمنا بتجهيز الماصة الدقيقة، يمكننا الانتقال إلى تنفيذ إجراء التثقيب الكهربائي للخلية الواحدة.

تتمثل المعدات الكهربائية المطلوبة لهذه التقنية في محفز ورسم تذبذبي (أوسيلوسكوب) وحامل ماصة مزود بسلك فضي يتم إدخاله في الماصة. نستخدم هنا جهاز ax separator 800 A من شركة axon instruments، ومع ذلك يمكن أيضاً استخدام المحفزات الشائعة مثل grass SD nine. يتم توصيل الـ ax separator بمرحلة الرأس (head stage)، والتي تعمل كواجهة ربط بين الـ ax separator وقطب السلك الفضي.

الأرضي الخارجي لشراغوف الضفدع هو ببساطة سلك فضي يظل كـ تلامس إلكتروني مع الشراغوف. أثناء عملية التثقيب الكهربائي، يتم توصيل كل من مرحلة الرأس وسلك الأرضي والأرضي الخارجي للشراغوف بمدخل جهاز راسم الإشارة (oscilloscope). وبمجرد إعداد المعدات الكهربائية، يمكن وضع الماصة في حامل الماصة.

يجب تركيب حامل الماصة على متلاعب دقيق ثلاثي المحاور يسمح بالحركة الدقيقة. يتطلب التثقيب الكهربائي للخلية الواحدة مجهراً بمسافة عمل جيدة، حيث يوفر ذلك مساحة أكبر للمناورة ويسمح بإدخال الماصة بزاوية تتراوح بين 30 إلى 45 درجة تقريباً.

بمجرد توصيل الجهاز بشكل صحيح، يمكننا البدء في إجراء التثقيب الكهربائي لخلية واحدة. أولاً، يتم تخدير الشراغيف عن طريق الغمر في 0.02%MS 2, 2 2، وعادة ما يتم تخدير الشراغيف بالكامل. وبعد مرور خمس دقائق تقريباً، يتم نقل شرغوف واحد إلى غرفة التثقيب الكهربائي.

باستخدام ماصة نقل بلاستيكية، يمكن صنع الغرفة بسهولة داخلياً عن طريق نحت تجويف على شكل شرغوف في كتلة صغيرة من السيليكون وإدخال سلك تأريض فضي بحيث يكون ملامساً لجلد الشرغوف عند وضعه في الغرفة. بعد ذلك، يضمن استخدام فرشاة رسم لتحديد وضعية الشرغوف أن يكون الجانب الظهري للأعلى. ثم يتم خفض الماصة الدقيقة حتى تلامس الجلد المجاور مباشرة للمنطقة المستهدفة.

سيؤدي الاستمرار في خفض الماصة في البداية إلى إحداث انبعاج في الجلد، ثم سيمر من خلاله إلى الأنسجة الكامنة تحته. أقوم هنا باستهداف الفص البصري في دماغ شرغوف الضفدع، وأهدف تحديداً إلى منطقة طبقة أجسام الخلايا.

إذا كنت تستخدم جهاز xi، فيمكن مراقبة مقاومة الماصة داخل النسيج. وبشكل عام، تتراوح المقاومة من 10 إلى حوالي 40 Mega ohms، وهي قيم تعمل بشكل جيد.

تعد مقاومة الماصة مؤشراً جيداً لمعرفة ما إذا كان قطر الطرف صغيراً جداً أو ما إذا كان الطرف مسدوداً، وفي هذه الحالة ستكون المقاومة عالية. ومن ناحية أخرى، إذا كان قطر الطرف كبيراً جداً أو إذا كان الطرف مكسوراً، فستكون مقاومة الماصة منخفضة. وبالرغم من ذلك، لا يمكن قياس المقاومة المطلقة للماصة عند استخدام محفز تقليدي.

تعد قراءة راسم الإشارة مقياساً غير مباشر لمقاومة الماصة بالنسبة لصبغات الديكستران الفلورية. يتكون التحفيز من سلسلة نبضات موجية مربعة موجبة مدتها 10 millisecond يتم تطبيقها بتردد 300 hertz. وتستغرق النبضات الفردية 300 microseconds في مدتها ويتم توصيلها بجهد كهربائي قدره 50 volts.

باستخدام هذه الإعدادات، يتم دفع الصبغة الفلورية من رأس الماصة كما يمكن ملاحظته عند تطبيق المحفز بعد السبر الكهربائي. يتم سحب الماصة من موقع واحد، وتكرار العملية في مواقع مختلفة داخل النسيج لتحسين الحصيلة. وأثناء إرسال سلسلة نبضات الجهد، يجب مراقبة سعة النبضات الناتجة على راسم الإشارات (الأوسيلوسكوب) وضبط السعة لتكون بين 1 و 1.5 microamps إذا لزم الأمر.

إذا ظلت سعة النبضة منخفضة بعد زيادة الجهد بشكل كبير أو انخفضت أثناء سير الإجراء، فإن هذا يشير بقوة إلى أن الطرف مسدود أو أن قطر الطرف صغير جداً. وقد يكون هذا الأمر محبطاً للغاية عند حدوثه. ومن ناحية أخرى، إذا ظلت السعة مرتفعة بعد تقليل الجهد المطبق بشكل كبير أو ارتفعت أثناء سير الإجراء، فإن هذا يشير بقوة إلى أن الطرف إما واسع جداً أو أنه مكسور، أو أن الأطراف تتعرض للكسر.

غالبًا ما أشعر بتأثر عاطفي وحزن شديدين. وكما ذكرنا سابقًا، فإن ميزة استخدام الأصباغ الفلورية تكمن في إمكانية التحقق الفوري مما إذا كانت الخلايا المفردة قد خضعت لعملية التثقيب الكهربائي باستخدام معاملات التحفيز المحددة. وإذا ظهرت الخلايا باهتة جدًا أو لم يتم وسم أي خلية، فيبدأ المرء بزيادة كل معامل من معاملات التحفيز تدريجيًا وبشكل مستقل حتى تظهر الخلايا الموسومة بوضوح وبإضاءة قوية مثل هذه؛ إن رؤية خلايا موسومة بشكل جيد تجعل يومي أفضل.

من ناحية أخرى، إذا تبين أن العديد من الخلايا قد وُسمت، يتم تقليل معاملات التحفيز تدريجياً حتى يظهر أن خلية واحدة فقط قد وُسمت بسطوع مثل هذه الخلية. إن رؤية خلايا مُوسمة بسطوع أمر مرضٍ حقاً. وفي حالة الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA)، تكون سلاسل النبضات المستخدمة عبارة عن نبضات سالبة مدتها 1 millisecond تُقدم بتردد 300 hertz، وتكون مدة السلسلة 500 milliseconds.

بعد عملية التثقيب الكهربائي، تُوضع شراغف TA في محلول تربية جديد حيث تتعافى بسرعة من التخدير. عادةً، بعد التثقيب الكهربائي من 50 إلى مائة من شراغف TA، يمكننا البدء في فحصها، وهو ما سأعرضه لكم تالياً. وقبل البدء في تجارب التصوير، من المفيد فحص الشراغف التي خضعت للتثقيب الكهربائي سريعاً باستخدام مجهر فلوري فوقي رأسي.

من أجل تحديد شرغوفات الضفادع التي تحتوي على عصبونات مناسبة للتصوير، يتم تخدير الشرغوفات ثم وضعها في غرفة سيجار وتغطيتها بشريحة غطاء. بعد ذلك، يتم فحص أدمغة الشرغوفات الفردية بسرعة تحت ضوء فلوري فوقي لتحديد ما إذا كانت هناك عصبونات مفردة مُعلمة فلورياً. لاحظ أن التعرض المفرط للضوء الفلوري فوقي سيؤدي إلى تسمم ضوئي قد يقتل الخلية المُعلمة؛ لذا، حاول تقليل مقدار الوقت الذي تتعرض فيه الخلايا للضوء الفلوري.

في حالة صبغات الديكستران، يمكن أن يتم الفحص بعد 30 دقيقة فقط من عملية التثقيب الكهربائي. ومع ذلك، وجدنا أن الفترات الأطول ترتبط بمستويات أقل من الفلورة الخلفية. أما في حالة البلازميد، فعادة ما يتم فحص DNA بعد 12 ساعة على الأقل من عملية التثقيب الكهربائي.

نستخدم بشكل روتيني عملية التثقيب الكهربائي للخلية الواحدة لوسم العصبونات فلوروسنتياً داخل السقف البصري لشرغوف البرمائيات. مجهر الفوتونين لدينا مصنع خصيصاً، حيث تم بناؤه من مجهر Olympus FV 300 البؤري ومصدر ضوء ليزر Chameleon XP. وعادةً ما نستخدم طولاً موجياً يبلغ 910 nanometers لتصوير GFP.

بمجرد العثور على شرغوف يحتوي على عصبون AL واحد مُعلم ووضعه على منصة التصوير ثنائي الفوتون، نبدأ في إجراء تصوير فوتوني بفاصل زمني للعصبونات اللمسية عبر فترات زمنية مختلفة. يتيح لنا ذلك مراقبة أنماط النمو الديناميكية للتفرعات الشجيرية لخلايا AL. نرى هنا مثالاً لعصبون يعبر عن GFP تم تعليمه باستخدام التثقيب الكهربائي للخلية الواحدة.

تم التقاط هذه الصورة باستخدام المجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي (in vivo) من أجل قياس النمو العصبي كمياً. وعادةً ما يتم إنشاء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد هيكلية لكل صورة عصبية. ويوفر التصوير بفاصل زمني مع فترات ممتدة رؤية متعمقة في العواقب طويلة المدى للتلاعب التجريبي.

نرى هنا عصبونًا غير ناضج يعبّر عن GFP تم تصويره يومياً على مدار أربعة أيام، وهو ما يشمل فترة تطوير تشجره التغصني. تم التقاط هذه الصور باستخدام مجهر الفوتونين وهي معروضة كإسقاطات Z. يتيح لنا التصوير السريع بنظام الفاصل الزمني مراقبة طبيعة العمليات الأكثر ديناميكية للنمو العصبي، بما في ذلك تشكّل وتراجع الخيوط الدقيقة التغصنية.

يوضح هذا المقطع فيديو لعصبون ناضج نسبيًا يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، حيث تم تصويره ثلاثيًا الأبعاد كل دقيقتين لمدة ساعة واحدة. وهذا مثال لعصبون غير ناضج يعبر عن GFP تم تصويره كل خمس دقائق على مدار ساعة. وتتميز العصبونات الأصغر سنًا بديناميكية عالية، حيث تظهر نموًا واسع النطاق في التفرعات وانكماشًا في تلك التفرعات.

يُظهر عرض مكبّر لهذه العصبونة التي تعبر عن GFP الإضافة والانكماش المستمر للتفرعات الشجيرية الخيطية (dendritic filopodia)، وهو أمر نموذجي للعصبونات النامية في هذا النظام. إن شفافية شرغوف الألبينو وإمكانية الوصول إلى دماغه تجعل هذا النظام النموذجي مناسباً بشكل مثالي لتصور النمو العصبي والأحداث داخل الخلوية ضمن كائن حي. يتيح لنا التثقيب الكهربائي للخلية الواحدة تصور نمو عصبونة واحدة وإجراء تلاعبات ذاتية خلوية داخل دماغ غير معدل في جوانبه الأخرى.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء التثقيب الكهربائي للخلية الواحدة في أقطاب zap lavis tat، على الرغم من أن تركيزنا هنا ينصب على التثقيب الكهربائي في أقطاب TA. وقد استُخدمت هذه التقنية في كائنات أخرى، كما استُخدمت أيضاً في شرائح الحصين ومزارع الخلايا المفككة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التأكد من تعديل رؤوس الماصات ومعلمات التحفيز باستمرار للحفاظ على إنتاجية عالية.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.