اختبار المقايسة المناعية المضاعفة فلوروميتريك المنهجية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن الأجسام المضادة ضد العوامل المعدية العارضة في حيوانات التجارب. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تحضين المصل المراد اختباره مع كرات مجهرية مغلفة بالمستضد. بعد ذلك، يتم تحضين المصل مع جسم مضاد للغلوبولين المناعي خاص بالنوع وموسوم بالبيوتين، والذي يقوم بالكشف عن أي معقدات مناعية تتكون من المستضد والجسم المضاد.

بعد ذلك، يتم إضافة محلول FICO eryn Fluor force المسمى بالستريبتفيدين (streptavidin) للكشف عن أي إيمونوغلوبولين مبيوتني (biotinylated immunoglobulin)، وتكون النتائج المستخلصة إما إيجابية أو سلبية للحالة المناعية للعوامل الشائعة في القوارض المختبرية، وذلك بناءً على التألق متعدد الإرسال (multiplex fluorescence)، والصيغة النهائية للمقايسة المناعية (immunoassay net score)، وقيم العينات المتألقة. وتكمن الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل ELISA في أن MFIA هي مقايسة متعددة، مما يتيح للباحث إجراء مسح لما يصل إلى مائة مقايسة مختلفة في اختبار واحد.

تساهم هذه التقنية في تقليل كمية عينات المصل والمواد الاستهلاكية المستخدمة في الطرق الحالية، مع زيادة كمية المعلومات المستخلصة من اختبار واحد. لقد طرأت لنا فكرة استخدام هذه الطريقة أثناء اختبار عدد كبير من عينات المصل للكشف عن عوامل متعددة، ورغبتنا في تقليل الجهد المبذول ووقت الاختبار. ستقوم دونا كوهين، وهي كبيرة تقنيين في مختبرنا، باستعراض هذا الإجراء. للبدء، قم بتجهيز المحلولين المنظمين المطلوبين لإجراء المقايسة المناعية الفلورية المتعددة (MFIA).

الأول هو مخفف أولي، يتوفر من شركة Charles River ويحتوي على عوامل حجب مملوكة لتقليل التفاعلات غير النوعية لمحلول غسيل المقايسة. قم بتحضير محلول من PBS مع 1%BSA بأس هيدروجيني pH 7.4 لإزالة الجسيمات. قم بترشيح المحلول المنظم عبر وحدة ترشيح علوية للقارورة بمسامية 0.2 micron في حاويات معقمة وموسومة باستخدام محلول غسيل المقايسة.

قم بتحضير تركيزات مضاعفة (2x) من الأجسام المضادة لنوع الحيوان البيوتينية (biotinylated antis species)، سواء كانت IGG أو BAG، ومن strep AVID و FICO erything أو SPE، والتي ستُستخدم لوسم معقدات المستضد والأجسام المضادة المتكونة خلال خطوة تحضين المصل المختبر. لتحضير العينات، قم بتجهيز المواد والمواد الاستهلاكية التالية: ماصات دقيقة (micropipets) متعددة القنوات وأحادية القنوات مع رؤوسها (tips)، وأطباق معايرة دقيقة (microtiter plates) ذات 96 بئراً ومنخفضة الارتباط بالبروتين لتخفيف البروتين. بعد جمع عينات الدم وعزل المصل، قم برج المصل بجهاز vortex لفترة وجيزة قبل تخفيف العينات في المخفف الأولي داخل طبق معايرة دقيقة ذو 96 بئراً لضمان تفريغ البئر بشكل سليم وموحد. قم بترطيب كل بئر في طبق الاختبار ذو الـ 96 بئراً مسبقاً باستخدام محلول غسيل المقايسة، ثم اسحب المحلول ببطء طوال فترة إجراء المقايسة.

يجب أن تستغرق عملية السحب من خمس إلى 10 ثوانٍ لمنع تكتل الحبيبات وانضغاطها في غشاء المرشح، وكلاهما يمكن أن يؤدي إلى إبطاء أوقات القراءة في نهاية المقايسة. تحقق من توقف تصريف السائل عن طريق تجفيف الجانب السفلي من لوحة الاختبار باستخدام مناشف ورقية. من المهم تجفيف لوحة الاختبار بعد كل خطوة غسل لمنع سحب السوائل من الآبار أثناء التحضين.

لتحضير الخرزات، ابدأ برجّ معلق الخرزات المقترنة المخزون باستخدام جهاز vortex. ثم قم بتعرضها للموجات فوق الصوتية لفترة وجيزة في حمام مائي. من الضروري إعادة تعليق الخرزات بشكل صحيح لمنع تكون تجمعات من الخرزات المتكتلة، والتي قد تؤدي إلى زيادة زمن القراءة.

بعد ذلك، قم بتوزيع المعلق المخزون بتركيز 20x إلى محلول خرزات عمل بتركيز 2x في المخفف الأولي. ثم وزع 50 µL من معلق الخرزات بتركيز 2x في كل بئر اختبار من لوحة الاختبار المبللة مسبقاً. وباستخدام الماصة، أضف 50 µL من كل مصل اختبار ومصل ضابط بتركيز 2x إلى لوحة الاختبار وفقاً لمخطط لوحة محدد مسبقاً.

ثبّت الغطاء على الطبق. غطِّ الطبق بورق الألمنيوم واتركه في الحاضنة لمدة 60 minutes على هزاز مداري في درجة حرارة الغرفة لتجنب تبخر المحاليل الذي قد يؤدي إلى فشل المقايسة. حافظ على تغطية طبق الاختبار بغطاء الطبق خلال جميع خطوات الحضن.

بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون سرعة الرج أكبر من 400 وأقل من 700 RPMs لضمان بقاء الخرزات في حالة تعليق، مما يسمح للأجسام المضادة في المصل بالوصول إلى جميع أسطح المستضدات المقترنة. بعد غسل اللوحة في عمليات تحضين متتالية للخرزات باستخدام BAG و SPE، اغسل العينات مرة أخرى. ثم أعد تعليق الخرزات بإضافة 125 microliters من assay, wash, buffer، والرج لمدة دقيقتين قبل قراءة اللوحة.

ضعه في قارئ المقايسة في غضون 10 دقائق من إعادة تعليق الخرزات، حيث تمر الخرزات واحدة تلو الأخرى عبر كاشف حيث تتعرض لليزرين. يقوم أحد أشعة الليزر بتحفيز الأصباغ الداخلية التي تحدد مجموعة ألوان الخرزات، بينما يقوم الليزر الآخر بتحفيز صبغة مراسل FICO erything. ويتم تسجيل شدة فلورة FICO erything لعدد محدد مسبقاً من الخرزات على أنها قيمة FM FI؛ اقرأ البئر الأول للتحقق من أن لوحة الخرزات المختارة تطابق ملف تعريف الخرزات في آبار الاختبار.

إذا سقطت الخرزات خارج منطقة الخرزات المحددة لها في شاشة البروتوكول، فهذا يعني أنه قد تم اختيار ملف تعريف غير صحيح. فالخرزات التي تمت إعادة تعليقها بشكل صحيح ستملأ مناطقها المحددة كما هو موضح في برنامج قارئ المقايسة. أما إذا كانت الخرزات متكتلة، فستملأ مناطقها بمعدل بطيء.

يمكنك إخراج لوحة الاختبار من القارئ وإعادة تعليق الآبار يدويًا لفصل الحبيبات. أخرج لوحة الاختبار من القارئ، وباستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بعملية التدوير (triturate) لكل بئر من ثلاث إلى أربع مرات. بعد ذلك، أعِد لوحة الاختبار إلى القارئ واستمر في فحص النتائج.

قم بالإبلاغ عن الأخطاء مثل عدم كفاية عدد الخرزات أو انخفاض درجات خرزات IgG anti IgG، وكرر المقايسة لهذه العينات. بعد تصدير البيانات إلى Excel وحساب صافي MFI، حدد ما إذا كانت أي من ضوابط مقايسة لوحة الاختبار قد فشلت، باستثناء المصل المناعي عالي المدى. تُعتبر أي ضوابط فاشلة غير مقبولة ويجب تكرار المقايسة.

يمثل هذا الجدول بيانات مصل الاختبار وضوابط المقايسة من لوحة مقايسة نموذجية. وقد اجتازت جميع ضوابط IgG. وتشير نتائج الاختبار لهذه اللوحة إلى فشل العديد من عينات التفاعل النسيجي وعينات ضوابط IgG، كما هو موضح في الآبار ذات اللون البرتقالي.

يشير كل من A1C 1 وF1 إلى فشل في تفاعلية نسيج TC حيث تظهر درجة TC بين قوسين، بينما يوضح كل من Wells B 1 وE 1 نوعين من حالات فشل التحكم الداخلي لـ IgG، وهما نقص في الأجسام المضادة للاختبار أو في كواشف الاختبار، على التوالي في BAG أو SPE. ولا يتم تفسير نتائج لوحة الاختبار إلا إذا استوفى تحكم ملاءمة النظام وتحكم المصل معايير القبول الموضحة هنا. ويمكن أن تظهر الكرات المجهرية المغلفة بـ immunoglobulin مضاد لمصل الاختبار خاص بنوع معين درجات فشل نتيجة إضافة عينة غير كافية، أو تخفيف عالٍ جداً للعينة، أو نوع غير صحيح من الأنواع، أو اختبار مصل من مضيف يعاني من نقص المناعة.

إذا كانت نتائج الضبط في مقايسة الاختبار التجريبية مرضية، يتم تصنيف درجات المقايسات الفردية وفقاً لما يلي. وبناءً على هذا الإجراء، يجب استخدام طرق إضافية مثل Eliza أو IFA و/أو Western blot لتأكيد النتائج الأولية غير المتوقعة أو الإيجابية. ومن الضروري التحقق من هذه النتائج قبل اتخاذ أي قرار بشأن إدارة الحيوانات.

يمكن القيام بذلك باستخدام منهجيات مختلفة على العينة نفسها أو عينات إضافية من المستعمرة ذاتها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء المقايسة المناعية الفلورية المتعددة، وكيفية تفسير النتائج التي يتم الحصول عليها في منشأتك. سيمكنك هذا من تقليل الجهد المبذول مع جمع المزيد من المعلومات من كل بئر من عينات الاختبار.