通过光流控分析在单细胞分辨率下评估嵌合抗原受体T细胞的多模态功能

摘要

利用CAR-T细胞的过继性T细胞疗法在治疗血液系统肿瘤方面展现出良好前景，但其持久疗效尚不一致。多功能T细胞与缓解的持久性相关，但常规检测方法会掩盖关键亚群。本文介绍一种基于光流控平台的单细胞工作流程，用于识别和分离高功能性的CAR-T细胞，以用于后续研究。

摘要

过继性T细胞疗法是一种新型治疗模式，在该疗法中，自体T细胞在回输前被基因改造以表达靶向肿瘤的嵌合抗原受体（CAR）。 离体 扩增后重新回输至患者体内。尽管在晚期血液系统恶性肿瘤患者中已展现出显著的抗肿瘤效力，但在相当一部分病例中未能实现持久的治疗反应。尽管多种个体化因素可能导致临床疗效的差异，但越来越多的证据表明，回输前CAR-T细胞产品中多功能T细胞所占比例与癌症缓解的持久性密切相关。然而，目前对CAR-T细胞产品的常规评估依赖于群体水平的测量或终点检测，限制了对功能更强亚群细胞的分离与研究。本文展示了一种利用光流控平台的工作流程，可对单个CAR-T细胞的细胞因子分泌谱及通过CD137表达所反映的活化状态进行评估，并可选择性地联合细胞毒活性检测。具有最强多模式功能特征的细胞可被分离出来，用于进一步分析，从而为下一代CAR-T细胞疗法的设计提供依据。

引言

表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞在晚期血液系统恶性肿瘤患者中已展现出显著的抗肿瘤效力^1,2然而，相当一部分接受治疗的患者最终仍会复发，这凸显了开发功能持久性更强的CAR-T细胞产品的必要性^3,4,5,6尽管多种特异性因素可能导致临床结果的差异，但越来越多的证据表明，输注前CAR-T细胞产品中多功能T细胞所占的比例与癌症缓解的持久性密切相关。因此，通过富集或改造具有更强多功能性的CAR-T细胞的策略，有望获得能够介导更持久临床应答的治疗性产品。^6,7,8遗憾的是，目前表征CAR-T细胞功能的方法在很大程度上依赖于群体水平的测量或终点检测，这限制了对具有增强多功能特性的特定亚群进行分离和深入研究的能力。例如，细胞因子分泌通常通过检测群体上清液或胞内染色来评估，后者虽可提供单细胞水平的信息，但需以细胞固定为代价。⁹同样，通常通过在T细胞与靶细胞共培养后定量检测靶细胞活力的下降来评估CAR-T细胞群体的细胞毒性潜能。¹⁰. 能力 在单细胞水平上评估有活力的CAR-T细胞的细胞因子分泌、活化状态及细胞溶解活性，有望推动具有更持久抗肿瘤疗效的治疗产品的开发。

本文介绍一种通过光流控单细胞平台同时对单个CAR-T细胞进行多模态功能分析的方法（图1）。该系统利用光电信定位技术（OEP），将细胞因子捕获微珠和单个细胞移动至空间分离的微腔中，从而实现对单个CAR-T细胞的功能评估（图2A）。在本实验方案中，我们展示了通过非病毒基因转移方法制备CAR-T细胞，并在与抗原表达阳性及阴性靶细胞共培养过程中，评估单个CAR-T细胞的细胞因子分泌情况以及通过CD137标志的活化状态（图3 和 图4）¹¹。通过比较标准CAR-T细胞与过表达c-Jun的CAR-T细胞，展示了该方法在区分不同修饰细胞产品之间细胞因子分泌谱和活化谱方面的潜力⁶。此外，还可利用光流控平台上的caspase活性检测或基于荧光的读数来评估单个靶细胞的杀伤活性（图2B）。然而，确定相互作用动力学需要进行延时成像分析，而该动力学特征可能因不同的CAR结构和实验条件而存在显著差异。类似地，模拟慢性刺激的重复杀伤实验则需要采用不同的实验流程。因此，本文仅描述进行细胞毒性评估的基本操作步骤，而不详述其具体应用。

根据所选的评估指标和靶标特性，可将表现出最强多模态功能的活体CAR-T细胞从仪器中卸下，并转移至96孔板的各个孔中，以进行后续研究（图2C）。

方案

注意：缓冲液和培养基的配制方法见表1。

1. 从白细胞减除系统锥体中分离CD8 T细胞

注意：所有步骤均须在组织培养生物安全柜中使用无菌、无菌操作技术进行。稀释、洗涤和重悬所用的全部培养基在整个操作过程中应保持在 4 °C。

1. 向两个50 mL离心管（分离管）中各加入15 mL细胞分离介质（密度为1.077 g/mL）。
2. 将白细胞减少系统（LRS）锥形管（锥端朝下）置于未加盖的50 mL离心管上方。使用灭菌剪刀剪断LRS锥下方延伸的塑料管。将LRS锥放置在打开的50 mL离心管上，并剪断其上方的塑料管。收集约8–10 mL血液至50 mL离心管中。
3. 用PBS + EDTA（按培养基与缓冲液列表中的说明配制）将50 mL离心管补至50 mL体积，并用移液器混匀稀释后的血液。将稀释后的血液等量分装至两个分离管中。
4. 将含有稀释血液的分离管在室温（RT）下以750 ×g离心15分钟，加速度设为9，减速度设为2。
5. 使用10 mL刻度移液管，小心收集每个分离管中的白膜层，并转移至新的50 mL离心管中。
6. 向每个50 mL离心管中加入PBS + EDTA至40 mL体积，重悬细胞以获得单细胞悬液。将单细胞悬液在4 °C下以300 ×g离心10分钟。吸除上清液。
7. 将细胞沉淀重悬并合并于40 mL PBS + EDTA中。将单细胞悬液在4 °C下以300 ×g离心10分钟。吸除上清液。
8. 用PBS + EDTA重悬细胞沉淀，并通过台盼蓝染色测定外周血单个核细胞（PBMC）悬液的活细胞密度。
   注：台盼蓝是一种不能穿透活细胞膜的染料，可染色DNA。因此，活的PBMC和无核细胞（如红细胞）均不会被染色。在测定活PBMC密度时，必须排除小细胞（例如红细胞）。
9. 将所需数量的PBMC转移至新的50 mL离心管中，用于CD8⁺ T细胞的磁珠富集。估计起始所需的PBMC数量应为期望获得的CD8⁺ T细胞数量的10倍。操作过程中保持试剂处于低温状态。
10. 将PBMC悬液在4 °C下以300 ×g离心10分钟。吸除上清液。每1 × 10⁷个细胞用40 µL MACS缓冲液（按培养基与缓冲液列表中的说明配制）重悬细胞沉淀。
11. 每1 × 10⁷个细胞加入10 µL CD8⁺ T细胞生物素化抗体混合液。通过移液混匀，在4 °C下孵育5分钟。
12. 每1 × 10⁷个细胞加入30 µL MACS缓冲液。每1 × 10⁷个细胞加入20 µL CD8⁺ T细胞微珠。通过移液混匀，在4 °C下孵育10分钟。
13. 将预冷的LS柱安装在磁铁上，在其下方放置一个15 mL离心管以收集流穿液。用3 mL MACS缓冲液平衡每个LS柱。
14. 使用同一个15 mL离心管作为收集管，将细胞悬液加样至已平衡的LS柱。用1 mL MACS缓冲液洗涤柱子3次。每次洗涤需待1 mL缓冲液完全通过LS柱后，再进行下一次洗涤。
15. 小心重悬所收集的细胞，并通过台盼蓝染色测定富集后的CD8⁺ T细胞悬液的活细胞密度。

2. 基于微珠的CD8⁺ T细胞激活

1. 根据T细胞与磁珠1:1的比例，计算所需的人源CD3/CD28磁珠数量。激活磁珠原液浓度为每25 µL含1 x 10⁶个磁珠。
2. 在转移计算体积的磁珠悬液至15 mL锥形管前，轻轻涡旋振荡激活磁珠至少30 秒。加入等体积培养基洗涤磁珠，并涡旋振荡至少5秒。
3. 将15 mL锥形管放入相应的磁力架中静置1 分钟，使磁珠吸附于管壁。吸除并弃去上清液。
4. 计算使T细胞终浓度达到1 x 10⁶个T细胞/mL所需的培养基体积。从磁力架上取下锥形管，将磁珠重悬于计算体积的培养基中。加入重组人IL-2，使其终浓度为50 U/mL。
5. 将完全补充的培养基转移至含有T细胞的管中并混匀。将细胞悬液接种至适当的细胞培养容器中（例如，48孔板每孔1 mL，24孔板每孔2 mL），于37°C孵育40小时。

3. 通过核转染非病毒基因转移生成CAR-T细胞

注意：预热培养基（37 °C）、试剂（室温）和离心机（室温）对于实现高效的基因转导至关重要。

1. 准备并标记一个48孔板，每孔加入1 每个核转染条件所需的细胞培养基毫升数。将培养板孵育至少30分钟 分钟，以提供温暖和 CO₂调节至生理pH的培养基
2. 打开核转染仪，选择16孔条中需要进行核转染的孔位。选择合适的程序（例如，FI-115以获得高转染效率，或EO-115以获得更高的细胞存活率）。
3. 从培养箱中取出含有T细胞的细胞培养板，使用显微镜观察细胞的形态，初步判断激活是否成功。成功激活的T细胞应呈现均匀的聚集体并具有增大的细胞形态。培养基颜色由新鲜培养基的红色变为微橙色，表明细胞代谢活性增强，是激活成功的良好迹象。此时可通过流式细胞术检测早期激活标志物CD25和CD69，以确认激活效果。
4. 重悬、收集并计数活化的T细胞。根据1.2至2的倍数计算所需T细胞数量 x 10⁶ 每种条件下 T 细胞的数量。将计算好的体积转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中，在 200 x g 室温下孵育10分钟。
5. 吸弃上清液，用 10 mL 温热的 PBS 洗涤 T 细胞。在 200 x g 10分钟 室温下离心5分钟。利用离心时间解冻编码CAR的质粒，其DNA浓度通常为1 µg/µL。针对每种核转染条件，分别在无DNA酶的1.5 mL微量离心管中加入转座酶编码质粒（SB100x，1.0 µg）或微环质粒（0.5 µg），以及CAR编码质粒（1.0 µg）或微环质粒（0.6 µg），进行组装。
6. 准备足量的P3 Nucleofector溶液（每份条件：16.4 µL Nucleofector溶液 + 3.6 µL Supplement）。
7. 从离心机中取出含有T细胞的15 mL锥形管，吸除上清液，再次离心1次 200 分钟 x g 用200 µL移液器小心吸除尽可能多的缓冲液，避免触碰细胞沉淀，以收集底部残留液体。
8. 立即用每种条件下20 µL P3缓冲液（见材料列表）重悬T细胞沉淀。将20 µL P3缓冲液中的细胞悬液转移至含有相应质粒的1.5 mL微量离心管中，轻轻混匀，避免引入气泡，随后将细胞悬液转移至16孔核转染条中。轻轻敲击以排除孔底部的任何气泡。
9. 将16孔条带放入4-D核转染系统中，并启动核转染程序。核转染成功后，每个选定孔的屏幕上应可见一个绿色十字。
10. 立即从已准备好的48孔板中加入100 µL预热的培养基，随后将16孔条带于37°C孵育10分钟 在培养箱中孵育 min。
11. 轻轻重悬2至3次，将细胞悬液转移至已准备好的48孔板中，然后放回培养箱。
12. 4-5 天后 h，小心地从每个孔中移除 500 µL 培养基，并小心加入 500 µL 新鲜且预热的培养液，其中添加了 50 U/mL 重组人 IL-2
13. 每隔一天进行常规换液以扩增细胞，保持细胞密度在0.5至2之间 x 10⁶ T 细胞/mL
14. 第6天，去除CD3/CD28激活磁珠。轻轻重悬细胞10次，收集T细胞，并将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中。将15 mL圆锥形离心管置于相应的磁铁上，静置1分钟 最小
15. 吸弃细胞悬液，转移至新的培养板中，并用添加了IL-2（终浓度为50）的新鲜细胞培养基喂养细胞 U/mL。磁珠应保持可见，附着在置于磁铁中的15 mL锥形管侧壁上。
16. 第7天通过流式细胞术分析相应的CAR或替代标记物的表达，以评估基因转导效率，随后于第8天进行磁珠分选富集转导阳性CAR T细胞（分选策略见 补充图1).

4. 转基因阳性T细胞的磁珠富集

注意：所有步骤均需在组织培养生物安全柜中使用无菌、无菌技术进行操作。用于稀释、洗涤和重悬的所有培养基在整个操作过程中应保持在 4 °C。

1. 轻柔重悬T细胞并转移至15 mL锥形管中收集。计数T细胞，取需进行磁珠富集的细胞数量，离心10分钟。 分钟，300 x g.
2. 吸弃上清液，加入10 mL缓冲液重悬细胞进行洗涤 毫升 MACS 缓冲液。离心 10 分钟 分钟 在300 x g吸弃上清液。
3. 计算针对替代标志物（如 tEGFR）的生物素化抗体所需用量。通常情况下，抗体应按每 1 µL 对应 1 × 10⁶ 细胞
4. 以 1 × 10⁶ 个细胞/mL 的密度重悬 T 细胞 x 10⁷ 每毫升细胞悬液中加入计算量的生物素标记抗体，孵育20分钟 4 °C 下，最小值
5. 加入10进行洗涤 毫升 MACS 缓冲液并离心 10 分钟，300 x g吸出并弃去上清液。
6. 将T细胞重悬于1 x 10⁷ 每80 µL MACS缓冲液中加入20 µL抗生物素微珠。 x 10⁷ 细胞。充分混匀，孵育15分钟 4 °C 下，最小时间（min）
7. 加入10进行洗涤 毫升 MACS 缓冲液，离心 10 300 分钟 x g吸弃上清液。用500 µL MACS缓冲液重悬细胞。
8. 将预冷的LS柱置于磁铁上，在其下方放置一个15 mL离心管以收集流穿液。
9. 用3 mL MACS缓冲液平衡每根LS柱。使用同一个15 mL圆底离心管作为收集管，将细胞悬液上样至已平衡的LS柱中。
10. 用 1 mL MACS 缓冲液洗涤色谱柱 3 次。每次加入 1 mL 洗涤液后，待其完全流经 LS 色谱柱，再进行下一次洗涤。
11. 为收集转基因阳性细胞，将LS柱从磁铁上取下并放入新的15 mL锥形管中。加入5 mL MACS缓冲液，并轻柔地将液体推出柱子。
12. 计数分离的细胞，并离心10分钟 300 分钟 x g将转基因阳性细胞重悬于适量添加IL-2的培养基中，并孵育至进行功能性和/或表型评估。在开始实验流程前，通过染色检测CAR或替代性转导标志物以进行纯度检查。补充图2).

5. 系统准备

1. 打开仪器并启动Cell Analysis Suite (CAS) 软件。确保废液收集容器为空，并确认加湿柱中有水。
2. 进入工作流程面板，打开完整清洗（Full Clean）工作流程（系统安装时已预载）。
   注意：建议在实验开始后的72小时内运行完整清洗（Full Clean）工作流程。
3. 完成所有检查后，点击开始（Start）继续。当系统提示时，将试剂仓插槽中的每个锥形管和试剂瓶更换为装有BLI清洗液的新容器，然后点击运行（Run）图标继续。
4. 当系统提示时，将试剂仓插槽中的每个锥形管和试剂瓶更换为装有无菌水的新容器，然后点击运行（Run）图标继续。
5. 打开飞行前检查（Pre-flight Check）工作流程（系统安装时已预载），完成所有检查后点击开始（Start）继续。
6. 准备一个50 mL锥形管，加入2 mL润湿液；另准备一个50 mL锥形管，加入39.6 mL的1×DPBS和400 µL润湿添加剂。
7. 当系统提示时，将冲洗芯片更换为光流控芯片，然后点击运行（Run）图标继续。在关闭样品巢之前，使用70%乙醇小心清洁光流控芯片表面及巢套管。
8. 当系统提示时，将试剂仓插槽中的每个锥形管和试剂瓶更换为装有相应溶液的新容器。

6. 检测流程创建

1. 进入工作流程面板。选择 创建新工作流程 (+)，选择 Opto T 细胞分析，然后从下拉菜单中选择 MCA 和细胞毒性检测。
2. 双击 多重细胞因子微球加载 以展开微球加载列表。如果检测的细胞因子靶标少于 3 个，请点击 X 从微球加载列表中删除相应的细胞因子微球。
3. 使用适当的微球类型、细胞因子靶标和导入位置更新每个字段。
   注意：无论微球加载条目如何排列，CAS 软件将自动按照 Cy5 荧光强度从高到低的顺序加载每种细胞因子捕获微球。
4. 双击 优先 APC 加载（含对照） 以展开靶细胞加载列表。如果检测的对照靶细胞系和样本靶细胞系均超过 1 个，请添加额外的细胞加载步骤。
5. 使用所需的靶细胞系名称、需绘制的视野（FOVs）以及 APC 筛选标准（通过指定靶标绘制筛选（TPS）模板文件）更新每个字段。
6. 选择 T 细胞加载配置，并选择 多个细胞系。双击 优先 T 细胞加载 以展开 T 细胞加载列表。
7. 使用所需的 T 细胞系名称、需绘制的视野（FOVs）以及 T 细胞筛选标准（通过指定 TPS 模板文件）更新每个字段。
8. 双击 细胞毒性检测 以展开细胞毒性检测设置。在工作流程特定的成像设置字段中，更新所需的检测持续时间（h）。
9. 双击 表型与细胞因子检测 以展开细胞因子分泌检测的染色方案。
10. 使用一抗和二抗染料的适当导入位置，更新芯片上染色字段。
11. 双击 T 细胞卸载 以展开卸载列表。将每芯片导出数（含空白）字段更新为所需的导出数量。保存并打开新创建的工作流程。

7. 细胞因子捕获微球上样

1. 对每个珠子小瓶进行超声处理和/或涡旋，以充分重悬捕获珠。使用细胞计数仪测定珠子浓度。
2. 将珠子密度调整为 4.5 × 10⁶ 个珠子/mL（A型珠子）或 4 × 10⁶ 个珠子/mL（B型珠子），溶于30 µL珠子稀释缓冲液中。
3. 将珠子悬液置于4 °C保存，直至提示将其加载到样品加载区。完成所有检查后，点击开始继续操作。
4. 当系统提示时，使用20 µL移液器混匀细胞因子珠子悬液，并将悬液加载至相应的导入位置。点击运行图标以继续。
5. 当系统提示时，目视检查多个视野，确认捕获珠已在微流控通道内均匀分布，并达到适当密度。若加载分布和/或密度不理想，请选择冲洗并导入以重新尝试珠子加载；若加载分布和密度均符合要求，则选择继续以开始固定珠子。
6. 对每种细胞因子捕获珠重复步骤7.3。

8. 靶细胞负载

1. 通过台盼蓝染色法测定每种靶细胞系的活细胞密度。
   注意：本实验流程假设靶细胞来源于活跃培养的细胞。若使用冻存细胞，则需确保细胞在复苏后至少传代一次，且存活率不低于90%。
2. 将1 × 10⁶个靶细胞收集至1.7 mL微量离心管中，在室温下以300 ×g离心5分钟。 吸除上清液。
3. 将每个靶细胞沉淀重悬于100 µL Annexin V染色溶液中，在室温下避光孵育30分钟。
4. 加入400 µL 1× Annexin V结合缓冲液，通过移液器吹打混匀。在室温下以300 ×g离心5分钟，吸除上清液。
5. 将每个靶细胞沉淀重悬于250 µL加CaCl₂的装载培养基中。将靶细胞悬液置于4 °C保存，直至提示将其加载至样品加载区。
6. 当系统提示时，使用200 µL移液器重悬靶细胞，并将细胞悬液加载至相应的导入位置。点击运行图标以继续。
7. 当系统提示时，目视检查多个视野，确认靶细胞已在微流控通道内均匀分布且密度适宜。若加载分布和/或密度不理想，选择冲洗并导入以重新尝试靶细胞加载。若加载分布和密度均符合要求，则选择继续以开始TPS设门。
8. 当系统提示时，进入手动操作界面，点击TPS，并加载所需的TPS模板。
9. 指定用于定义TPS设门的光学滤光片和成像视野，然后点击仅捕获以启动图像采集。
10. 打开设门配置编辑器，勾选Annexin复选框，并为X参数选择Annexin V染色的相应通道。从下拉菜单中选择对数（Delta中值亮度）。为Y参数选择OEP，从下拉菜单中选择最近邻。
11. 拖动设门区域的角点，排除Annexin V^hi和Nearest Neighbor^low的细胞，然后在不更改文件名的情况下保存TPS模板。
12. 返回工作流程界面，点击继续以进行分选。对每种靶细胞系重复步骤8.7–8.11。

9. T细胞载量

1. 通过台盼蓝染色法测定每种T细胞系的活细胞密度。
   注意：本实验流程假设T细胞来源于活跃培养的细胞。若使用冻存细胞，则需确保细胞在解冻后已培养过夜，且存活率至少达到90%。
2. 收获 1 × 10⁶ 将T细胞转入1.7 mL微量离心管中。以300 x g 室温下孵育5分钟。 吸去上清液。
3. 将每份靶细胞沉淀重悬于100 µL Annexin V染色液中。室温避光孵育30分钟。
4. 加入 400 µL 1x Annexin V 结合缓冲液，用移液器吹打重悬。在 300 x g 条件下离心 g 室温孵育5分钟。吸除上清液。
5. 将每个T细胞沉淀重悬于250 µL加有CaCl的加载培养基中₂将T细胞悬液置于4 °C保存，直至提示将其加入样本加载舱。
6. 当提示时，用200 µL移液器重悬靶细胞，并将T细胞悬液加入相应的导入位置。点击 运行 继续操作的图标。
7. 当系统提示时，需目视检查多个视野，以确认T细胞已在流体通道内均匀分布并达到适当密度。若加载分布和/或密度不理想，应选择 冲洗与导入 重新尝试T细胞加载。如果加载分布和密度合适，则选择 继续 开始 TPS 门控。
8. 当系统提示时，导航至 手动操作，然后点击 TPS，并加载所需的 TPS 模板。
9. 指定用于定义 TPS 门的光学滤光片和视野（FOV），然后单击 仅捕获 开始图像采集。
10. 打开 门控配置编辑器， 单击复选框以选择 膜联蛋白，并为X参数的Annexin V染色选择合适的通道。从下拉菜单中选择 Log（Delta 中值亮度）. 为Y参数选择OEP。从下拉菜单中选择 最近邻.
11. 拖动结果门控的角以排除Annexin V^你好 和最近邻^低 细胞，然后在不更改文件名的情况下保存 TPS 模板。
12. 返回到 工作流程 并单击 继续 继续进行细胞分装。对每种T细胞系重复步骤9.7–9.11。

10. 细胞毒性检测

1. 在50 mL锥形管中配制灌注培养基：将100 µL预解冻的NucView 530 Caspase-3试剂加入20 mL T细胞培养基中（储存浓度为1 mM，终浓度为5 µM）。
2. 当系统提示时，将试剂舱插槽中相应的锥形管更换为含有已配制灌注培养基的锥形管。点击运行图标继续操作。
   注意：20 mL灌注培养基足以对一个光流控芯片进行24小时的灌注。若细胞毒性检测需运行超过24小时，请额外配制灌注培养基。
3. 如需要，可在14小时后的任意时间点点击跳过剩余的TPS成像并继续工作流程，以终止任何剩余的细胞毒性检测成像步骤。

11. 表型与细胞因子检测

1. 在1.7 mL离心管中，将76 µL多重人CD8/NK Panel检测试剂与4 µL anti-CD137_BV421混合，配制一抗染色液。
2. 使用移液器混匀，4 °C避光保存，待提示加样时使用。当系统提示时，用20 µL移液器混匀一抗染色液，并加入指定的进样位置。点击运行图标继续操作。
3. 在另一支1.7 mL离心管中，将72 µL 1x DPBS与8 µL多重试剂盒中的SA-PE混合，配制二抗染色液。
   注意：应在一抗染色完成前预先配制好二抗染色液，确保可立即进行加样。
4. 使用移液器混匀，4 °C避光保存，待提示加样时使用。当系统提示时，用20 µL移液器混匀二抗染色液，并加入指定的进样位置。点击运行图标继续操作。

12. 检测分析

1. 转到桌面并打开Assay Analyzer软件。选择Assay Analyzer，然后选择Workflows，再选择要分析的工作流程类型。
2. 使用任意所需的条件定义需要卸载的关注组群。根据所需条件生成卸载列表，然后返回CAS软件并选择Continue selected workflow。
3. 确认复选框Create export list with Assay Analyzer for: [optofluidics Chip ID]已被勾选。

13. 卸载

1. 在96孔圆底板的每个孔中加入50 µL T细胞培养基。点击 继续 以进行细胞卸载。
2. 当系统提示时，打开芯片装载舱，掀开巢盖，取出光流控芯片。将芯片置于无菌培养皿中，并使光流控芯片顶部边缘抬高 >1°，以防止细胞从笔区滚出。在后续冲洗步骤期间，将芯片存放于无菌组织培养孵育箱中。
3. 将无菌的冲洗芯片放入空巢中，盖上巢盖，然后关闭芯片舱。点击 完成，然后点击 继续。
4. 当系统提示时，打开芯片装载舱，掀开巢盖，取出冲洗芯片。将光流控芯片重新放回空巢中，盖上巢盖，然后关闭芯片舱。点击运行图标以继续操作。
5. 当系统提示时，选择 打开 以显示 加载/卸载孔板 菜单。点击 卸载 以移除前一块孔板。更新孔板编号和孔板类型，选择 加载，然后选择 完成。
6. 点击 继续 以进行细胞卸载。当所有目标笔区的细胞卸载完成后，进入 手动操作 界面，打开芯片舱，取出含有目标细胞的孔板。

结果

根据所述方案，我们分别用抗原阴性或抗原阳性的图3 K562肿瘤细胞刺激模拟核转染、CAR以及过表达c-Jun的CAR T细胞，或不进行任何刺激（仅T细胞）。为确保结果可重复，我们预先评估了靶细胞抗原表达的均一性（补充图3）。由于这些细胞被分离在独立的纳米孔中，我们能够根据不同的实验条件，将其细胞因子表达谱表征为单产、双产或三产细胞（图3）。这些结果通过ELISA这一成熟的细胞因子检测方法进行了验证（补充图4）。

与预期一致，大多数模拟转染的T细胞在检测的三种细胞因子（TNF-α、IFN-γ和IL-2）中仍呈阴性。在标准CAR-T细胞中，抗原刺激后可检测到双阳性、三阳性和单阳性的IFN-γ分泌细胞，以及少量TNF-α和IL-2分泌细胞；而暴露于无抗原的肿瘤细胞则未诱导出多细胞因子分泌。有趣的是，c-Jun过表达在靶细胞接触后提高了双细胞因子和三细胞因子分泌细胞的比例，同时也增加了单细胞因子分泌细胞的比例，从而与标准CAR-T细胞相比，降低了细胞因子阴性细胞的整体比例。这些结果与先前报道一致，即通过强制表达该转录因子可调节CAR-T细胞的表型⁶。值得注意的是，我们观察到T细胞单独组中IFN-γ阳性细胞的比例高于无抗原肿瘤细胞组，这可能是由于该条件下分析的细胞数量较少所致。

为了进一步研究T细胞的活化情况，我们检测了经上述处理的空载核转染、CAR以及过表达c-Jun的CAR T细胞中CD137的表达水平（图4 和补充表1）。与空载核转染细胞相比，CAR T细胞在与表达抗原的K562靶细胞共孵育后，CD137的表达显著升高。此外，与标准CAR产品相比，过表达c-Jun的CAR T细胞中CD137阳性细胞的比例呈现出轻微升高的趋势。

综上所述，本研究所述方案能够在单细胞水平上评估CAR T细胞的细胞因子分泌及其活化状态，从而识别单细胞和多细胞来源的细胞因子产生细胞，并重现以往在群体水平上所描述的表型趋势⁶。

图1：通过光流控平台实现多模态分析的示意图流程。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：不同光流控平台功能的代表性图像。（A）通过光诱导电泳（OEP）将单个颗粒的序列导入各个笔区。图像左侧的笔区已在前序步骤中加载。（B）随时间推移，三个独立笔区中的细胞杀伤事件，显示表达绿色荧光蛋白（GFP）并表达抗原的肿瘤细胞。（C）通过光诱导电泳（OEP）从一个笔区导出单个细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：单细胞水平细胞因子分泌谱的代表性分析。 单个模拟核转染的 T 细胞或 CAR-T 细胞在含有 TNF-α、IL-2 和 IFN-γ 细胞因子捕获微珠的纳米笔中，与抗原阴性或抗原阳性的 K562 肿瘤细胞共培养，或不加肿瘤细胞进行培养。饼图显示了在共培养 24 小时后（终点分析），单个限定的 CAR-T 细胞中具有指定细胞因子分泌谱的比例。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：单细胞水平CD137表达的代表性分析。在存在或不存在抗原阴性或抗原阳性K562肿瘤细胞的条件下培养24小时后，对模拟核转染的T细胞或CAR-T细胞进行染色，检测其在光流控芯片上的CD137表面表达。小提琴图显示了模拟核转染T细胞和CAR-T细胞在培养24小时后CD137表达的荧光强度。请点击此处查看该图的放大版本。

T 细胞培养基组分（使用 0.22 µm 真空滤器进行无菌过滤）	体积（终浓度）
RPMI-1640（1× GlutaMAX，25 mM HEPES）	500 mL
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）	5 mL（90 U/mL）
β-巯基乙醇（50 mM）	0.5 mL（45 µM）
人血清（热灭活）	50 mL（9%）
GlutaMAX 补充剂（100×）	5 mL（0.9×）
肿瘤细胞培养基组分	体积（终浓度）
RPMI-1640（1× GlutaMAX，25 mM HEPES）	500 mL
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）	5 mL（90 U/mL）
胎牛血清（热灭活）	50 mL（9%）
MACS 缓冲液组分	体积（终浓度）
DPBS（无 Mg2+，无 Ca2+）	500 mL
胎牛血清（热灭活）	2.5 mL（0.5%）
EDTA（0.5 M）	2 mL（2 mM）
PBS/EDTA 缓冲液组分	体积（终浓度）
DPBS	500 mL
EDTA（0.5 M）	2 mL（2 mM）
上样缓冲液组分	体积（终浓度）
T 细胞培养基	18 mL
上样试剂	2 mL
含 CaCl2 的上样缓冲液组分	体积（终浓度）
上样缓冲液	499 µL
CaCl2	1.25 µL
灌流培养基+半胱天冬酶底物	体积（终浓度）
T 细胞培养基	20 mL
NucView 530 半胱天冬酶-3 底物（1 mM，溶于 DMSO）	100 µL
磁珠稀释缓冲液组分	体积（终浓度）
DPBS	800 µL
BSA（2% w/v）	100 µL（0.2% w/v）
Tween-20（10% w/v）	10 µL（0.1% w/v）

表1：培养基与缓冲液的配制。

补充图1。磁珠富集前评估基因转导效率的典型设门策略。 典型的等高线图和直方图展示了在完成基因转导后，用于鉴定表达CAR（tEGFR阳性）的CAR T细胞的设门策略。请点击此处下载该文件。

补充图 2。分选后的纯度质控。典型等高线图显示了磁性分选后表达 CAR（tEGFR 阳性）的 CAR T 细胞所占比例。请点击此处下载该文件

补充图 3。靶向肿瘤细胞上的抗原表达。代表性直方图显示通过流式细胞术检测的野生型 K562 肿瘤细胞或经基因改造表达 ROR1 的细胞，使用同型对照抗体或靶向 ROR1 的抗体进行染色。请点击此处下载该文件

补充图4. 使用标准ELISA检测细胞因子。 通过ELISA检测CAR与CAR+cJ T细胞在效靶比4:1条件下与K562^ROR1 肿瘤细胞共培养24小时后上清液中IL-2和IFN-γ的浓度。统计学显著性由非配对t检验确定，*P≤ 0.05，**P≤ 0.01，***P≤ 0.001，****P≤ 0.0001。请点击此处下载该文件。

补充表 1： 分析的细胞。 该表格列出了每种条件下分析的单个细胞数量。请点击此处下载该文件。

讨论

本实验流程可实现对单个CAR-T细胞在与抗原阳性及抗原阴性靶细胞共培养过程中细胞因子分泌和活化状态的评估，且可选择性地结合细胞溶解活性的检测。尽管在单细胞分辨率下获取多模态功能数据的能力为分析CAR-T细胞功能提供了前所未有的精确手段，但测量结果的可量化性在很大程度上依赖于OEP技术在每个微孔中加载相同数量的细胞因子捕获微珠、靶细胞和CAR-T细胞的准确性。因此，必须确保每种试剂或细胞样本的加载密度和TPS（每秒传输数）标准经过优化，以实现每个微孔中单微珠和/或单细胞的加载。虽然通过调整流体通道中微珠或细胞悬液的浓度可实现适当的微孔加载，但该平台的“冲洗”（Flush）和“导入”（Import）选项也可作为重新尝试加载过程的补充策略。

光流控芯片设计的一个优势在于将笔式布局分隔为22个独立的视野（FOV）。通过将表达不同CAR结构的工程化T细胞分别加载到光流控芯片内的不同FOV中，我们还能够评估一种强制过表达c-Jun的替代性CAR构建体是否相较于标准CAR构建体更能增强具有多模式功能的CAR-T细胞的生成（图3 和 图4）。由此，光流控平台为快速鉴定可能增强CAR-T细胞诱导癌症缓解持久性的候选CAR构建体提供了有效手段。值得注意的是，在单细胞水平上分析靶细胞与效应细胞之间的相互作用，需要对若干关键参数进行严格控制，例如肿瘤细胞上靶抗原表达的异质性以及CAR-T细胞群体的纯度（补充图2 和 补充图3）。

尽管我们主要关注评估IL-2、TNF-α和IFN-γ的分泌情况，但市面上可获得的多重细胞因子捕获检测面板能够检测多种可溶性分析物，从而为实验流程的定制化提供了广泛空间。近年来的发展表明，该领域也在向高维流式细胞术方向推进，为与不同免疫细胞类型的的功能谱分析相结合开辟了新的可能性^12,13。例如，未来应用可能包括筛选表达嵌合抗原受体（CAR）的多功能调节性T细胞（Tregs）。这类细胞可分泌多种抗炎性细胞因子，如TGF-β和IL-10¹⁴。因此，光流控系统的可适应性可能为细胞免疫疗法在非恶性疾病治疗新领域的拓展提供关键性见解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-D 核转染仪	Lonza
抗生物素微珠	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD3/CD28 Dynabeads	Thermo Fisher	11131D
CD8+ T细胞分离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-096-495
CELLSTAR 15 ml 锥形管（聚丙烯）	Greiner Bio-One	188271-N
CELLSTAR 50 ml 锥形管（聚丙烯）	Greiner Bio-One	227261
Corning 75 cm² U型斜颈细胞培养瓶，带塞密封盖	Corning	430720U
Costar 24孔透明TC处理多孔板，独立包装，无菌	Corning	3526
Costar 48孔透明TC处理多孔板，独立包装，无菌	Corning	3548
不含钙、镁的DPBS	Thermo Fisher	14190169
DynaMag-15 磁力架	Thermo Fisher	12301D
EGFR（Erbitux，西妥昔单抗）	Eli Lilly	NDC 66733-948-23	用于实验室内部偶联（生物素）
EGFR 抗体（C225（西妥昔单抗））[Alexa Fluor 647]	Novus Biologicals	NBP2-75903AF647
胎牛血清，经济型	Thermo Fisher	A5256801
GlutaMAX补充剂（100倍浓度）	Thermo Fisher	35050038
人IL-2，优质级	Miltenyi Biotec	130-097-748
人血清	Deutsches Rotes Kreuz (DRK)/ German Red Cross (GRC)	N/A
MACS细胞分离柱，LS型	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand支架	Miltenyi Biotec	130-042-303
P3 原代细胞 4D-核转染X试剂盒	Lonza	V4XP-3032
Pancoll human，密度：1.077 g/ml	PanBiotech	P04-60500
PE Annexin V 凋亡检测试剂盒 I	BD Biosciences	559763
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Thermo Fisher	15140122
Pierce 细胞表面生物素化与分离试剂盒	Thermo Fisher	A44390
QuadroMACS 起始试剂盒（LS）	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI 1640 培养基，含GlutaMAX补充剂和HEPES	Thermo Fisher	72400054
2、5、10、25 和 50 ml 移液管	Greiner Bio-One	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
台盼蓝染液（0.4%）	Thermo Fisher	15250-061
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
β-巯基乙醇（50 mM）	Thermo Fisher	31350010
Beacon 试剂
96孔圆底板	Corning	3799
Beacon 塑料冲洗芯片		500-00030
BLI 清洗液，次氯酸钠，0.825%	Bruker	520-08000
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A4161
Brilliant Violet 421 抗人CD137（4-1BB）抗体	Biolegend	309820
氯化钙（CaCl2）	Sigma-Aldrich	C5670
LEGENDplex 人IFN-γ 捕获微球 B3，13X	Biolegend	740545
LEGENDplex 人IL-2 捕获微球 A5，13X	Biolegend	740934
LEGENDplex 人Th细胞 panel 检测抗体 V02	Biolegend	741041
LEGENDplex 人TNF-α 捕获微球 B7，13X	Biolegend	740711
LEGENDplex SA-PE	Biolegend	740452
NucView 530 Caspase-3 底物，1 mM 溶于DMSO	Hölzel	B-10406
OptoSelect 芯片 3500	Bruker	500-12001
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379
Vegan Export Buffer	Bruker	520-00040
VWR 培养基瓶，方形，PETG，125 ml	VWR	216-2265
VWR 培养基瓶，方形，PETG，500 ml	VWR	216-2267
润湿添加剂	Bruker	520-08016
润湿液	Bruker	520-00009