基于微球的多重流式细胞术检测法用于CAR T细胞功能分析

摘要

本文介绍了一种基于多重微球的流式细胞术检测方法，可从小体积样本中定量分析嵌合抗原受体（CAR）-T细胞来源上清液中的多达12种细胞因子和效应分子，从而快速、可重复地评估基因工程T细胞的功能活性。

摘要

由于CAR T细胞具有异质性、复杂的免疫应答特性以及样本获取受限，对其进行表征分析面临诸多挑战。多重检测技术通过同时检测多种效应分子（包括细胞因子、趋化因子和细胞毒性介质），实现了对细胞功能的综合评估。本文介绍一种基于微球且适用于流式细胞术的多重检测方法，用于分析人源嵌合抗原受体（CAR）-T细胞分泌的效应分子。将CAR T细胞的上清液与多种荧光编码的捕获微球混合物共同孵育，这些微球表面偶联有针对特定分析物的抗体，可结合样本中的可溶性目标分子，形成微球-分析物复合物，随后通过标记的检测抗体进行识别。该检测体系包含一组免疫介质，如干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-2、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6、IL-10、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）以及颗粒酶B。通过使用预定义的标准品，可从单个样本中对多种分析物进行定量测定。数据采集与分析可借助仪器配套或基于网络的软件工具中的自动化设门方法完成，从而提高数据处理效率。综上所述，该多重检测方法可实现对CAR T细胞功能的多参数分析，适用于科学研究、质量控制检测、作用机制研究及功能特性表征等多种场景。

引言

功能性表征在嵌合抗原受体（CAR）T细胞检测中至关重要，因为它能够揭示这些疗法的效力、安全性和作用机制。了解细胞因子和细胞毒性介质的表达谱有助于评估治疗效果及潜在的不良反应，从而确保开发出安全有效的治疗方法。传统的单重检测方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA），存在诸多局限性，包括需要较大的样本量、耗时较长的处理过程，以及每种分析物都需要单独运行检测，同时在单个样本中的动态范围有限^1,2。相比之下，基于微球的多重检测技术可实现对多种可溶性介质的同步检测，显著减少处理时间和样本需求，同时扩大动态范围^1,2。这种高效且深入的分析能力使多重检测成为推动CAR T细胞研究与开发的重要工具^3,4,5。

本研究中介绍的多重检测利用了具有特定荧光特征的捕获微球，这些微球在异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）通道中表现出明确的荧光信号，并包被有针对可溶性分析物的特异性抗体。在与样本孵育过程中，这些微球可选择性地结合溶液中的目标分析物。在分析物被捕获后，加入检测抗体以形成针对特定分析物的夹心复合物。这些检测抗体可直接与别藻蓝蛋白（APC）偶联（直接检测），或与生物素偶联（间接检测）。对于间接检测，需进一步孵育APC标记的抗生物素抗体（图1）。最终形成的复合物——包括捕获微球、分析物和检测抗体——通过流式细胞术进行分析，以定量分析物的浓度。该多重检测为基于微孔板的技术，包含预定义的标准品，用于生成针对各分析物的标准曲线^1,2。

图1：细胞因子检测技术原理及检测流程。 该检测基于12种荧光编码的捕获微球群体，每种微球偶联有针对特定分析物的抗体。在样本孵育后，形成微球-分析物复合物，可通过流式细胞术使用特异性检测抗体进行检测。检测流程包括：1）在滤板上制备分析物标准品和待测样本；2）与捕获微球孵育；3）与生物素标记的抗分析物抗体孵育，形成夹心复合物；4）与APC标记的抗生物素抗体孵育；5）用缓冲液重悬以进行检测；6）样本采集。 请点击此处查看该图的放大版本。

本研究中描述的多重检测方法适用于配备蓝色（例如488 nm；FITC和PE通道）和红色激光（例如635 nm；APC通道）的标准流式细胞仪。由于流式细胞仪在科研实验室、临床环境和质量控制场所中广泛可用，这种兼容性有助于在无需额外专用仪器的情况下实现方法的推广应用⁵。在CAR T细胞功能检测的背景下，该方法可在常规可用的分析流程中实现对功能反应的多参数评估⁶。该检测方法通过同时定量关键分析物，为CAR T细胞研究提供了显著优势，这些分析物包括GM-CSF、颗粒酶B、干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、穿孔素以及肿瘤坏死因子（TNF）-α（人源细胞毒性检测面板）。这些介质对于理解CAR T细胞的激活、效应功能以及与安全性相关的细胞因子释放至关重要^4,5,7,8。

该检测流程包含使用仪器配套软件进行自动设门和数据分析的选项，以及不依赖仪器的基于网络的分析工具⁵。这些功能有助于简化CAR T细胞效应分子谱数据的处理过程，减少人工干预的程度。采用自动化分析可能有助于提高数据处理的一致性，并促进对功能检测结果的更高效评估⁸。

本方案介绍了一种可重复、可放大的多重CAR T细胞免疫介质分析方法。通过在单一样本中同时检测12种不同的分析物，该方法特别适用于机制研究、早期阶段研究以及同步开展的研究项目。在CAR T细胞治疗的后期阶段，减少检测的细胞因子数量可能是有益的，尤其是在受监管且时间敏感的药品放行质量控制（QC）环境中。为此，可从本方案提供的检测面板中选择1至7种细胞因子，构建定制化的细胞因子检测方法，并用于工程化T细胞分析的验证。因此，本方案非常适合应用于CAR T细胞治疗早期和后期各个阶段的研究及质量控制环境中的多种用途^3,4,5,9。

方案

所有人体样本均在获得书面知情同意后，从健康的匿名志愿者处采集。所有操作均经北莱茵医师协会伦理委员会（#2020272）批准，并依照必要的伦理和生物安全规定进行。

1. CAR T 细胞共培养

1. 在无或有同源抗原（例如，以2.5:1的效应细胞与靶细胞比例）存在的情况下，培养经基因工程改造的人源CAR T细胞。
2. 设定一个或多个时间点收集上清液，用于一次性分析分泌的细胞因子，或在特定时间范围内分析细胞因子的动力学，例如在4、8、16、24和48小时。
   注意：上清液可直接使用，也可冻存以备后续使用。

2. 标准品与样品制备

1. 向沉淀中加入 200 µL 缓冲液或细胞培养基，轻轻混匀以重悬分析物标准品。准备六支试剂管，对重悬后的标准品进行1:5系列稀释，稀释至3.2 pg/mL或0.6 pg/mL（根据具体分析物而定），并设置空白对照。
2. 收集CAR T细胞共培养上清液，例如共培养后16小时或24小时的上清液。可选地，同时收集CAR T细胞用于后续通过流式细胞术进行平行表型分析。
3. 将样品在4 °C条件下以10,000 × g离心10分钟。直接使用上清液，或根据需要进行稀释，使其浓度落在标准曲线范围内。

3. 检测流程

1. 涡旋震荡捕获珠混合液，使其充分重悬。取50 µL标准品或样本，加入20 µL预稀释的珠子，加入96孔滤板的孔中。
2. 室温避光振荡孵育2小时，转速为450 rpm。使用真空 manifold 或离心机，每孔用200 µL缓冲液洗涤两次。
3. 每孔加入100 µL以缓冲液按1:50预稀释的检测试剂1。室温避光振荡孵育1小时，转速为450 rpm。洗涤两次。
4. 每孔加入100 µL以缓冲液按1:50预稀释的检测试剂2。室温避光振荡孵育30分钟，转速为450 rpm。洗涤一次。
5. 检测时，将样本用200 µL缓冲液重悬。该检测流程的概览见图1。

4. 数据采集与分析

1. 使用配备蓝色和红色激光器的流式细胞仪获取数据（需要具备PE、FITC和APC通道）。使用MACSQuant流式细胞仪时，请采用 快速模式 全自动门控与数据分析模板。
2. 或者，将 FSC 或 MQD 数据文件上传至基于网络的 InspectoR 工具，该工具可自动进行定量细胞因子检测，并提供与所用仪器无关的、可直接导出的结果。
3. 务必验证12种不同捕获微球群体在FITC与PE通道中的正确分离。
4. 应用标准曲线计算细胞因子浓度，并导出和可视化结果。
5. 使用捕获珠管上的二维条形码进行 MACSQuant 流式细胞仪的数据采集，该条形码包含所有相关的采集设置。
   1. 登录软件后，选择 MACSPlex 过滤板 样本架并单击 条形码 单击工具栏上的按钮以激活二维码读取器。
   2. 将小瓶呈现给读者，确保其代码面向闪烁的光源，距离保持在0.5–2.5 cm的最优范围内。
   3. 在 自动标记 标签，分配 捕获微珠（MPx Cyt T-NK,h） 和 无标签对于细胞毒性T细胞/NK细胞标准品的系列稀释，定义各组位置，并在 设置 标签，选择 快速模式 与 类型：分析，模式：MACSPlex_Standard必要时轻柔混匀。
   4. 未知样本以类似方式分配，定义其位置，可选分组，以及选择 快速模式, 类型：分析，以及 模式：MACSPlex_样本 在 设置 标签，包括可选的样本编号和描述。
   5. 验证支架定义在其中是否正确 实验 确保滤板各孔中的液体量适当，然后开始检测。

结果

用于12种可溶性分析物的代表性捕获微珠群体的鉴定

使用流式细胞仪的FITC和PE通道鉴定捕获微球群体。在双轴图中可清晰分辨代表各个分析物的不同微球簇，包括IL-10、Granzyme B、MCP-1、IL-17A、Perforin、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-21、IL-4和GM-CSF（图2）。每个微球群均表现出独特的荧光信号，证实了所检测的细胞因子和效应分子实现了成功的多重检测并可明确区分。

图 2：代表性多重捕获微球群体的检测。 捕获微球具有内在的荧光强度，可用于区分不同分析物特异性的微球群体。该散点图显示了基于 FITC（B1）和 PE（B2）通道中荧光强度的分析物特异性信号分离情况。图像展示了编码 GM-CSF、Granzyme B、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、MCP-1（CCL2）、Perforin 和 TNF-α 的 12 种捕获微球群体的代表性图谱。请点击此处查看该图的放大版本。

CAR T细胞与肿瘤细胞共培养后的代表性细胞因子浓度谱

在CAR T细胞与肿瘤靶细胞共培养后，使用多重检测法的人类细胞毒性因子检测试剂盒对细胞因子浓度进行了定量分析（图3）。CAR T细胞分泌了高水平的颗粒酶B（49,950.2 pg/mL）、IFN-γ（48,367.8 pg/mL）、TNF-α（7,055.2 pg/mL）和GM-CSF（6,653.5 pg/mL），表明其在识别肿瘤细胞后发生了强烈活化并表现出显著的细胞毒性效应功能。IL-2水平超过检测上限（>10,000 pg/mL），符合强烈的增殖信号特征。该样本未进一步稀释或重新测定。相比之下，与调节性或替代性辅助T细胞反应相关的细胞因子，包括IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21和MCP-1，均处于较低水平或接近无法检测。这些结果表明，CAR T细胞主要引发了以高效应活性和有限免疫抑制性细胞因子产生为特征的Ⅰ型（Th1/细胞毒性）免疫应答。

图3： CAR T细胞与肿瘤细胞共培养后的代表性细胞因子谱型。 构建的嵌合抗原受体（CAR）T细胞与JeKo-1肿瘤细胞共培养过夜。培养16小时后收集细胞培养上清液，并通过离心去除颗粒物。将样品稀释后，使用多重检测法中的细胞毒性检测试剂盒（human cytotoxicity panel）进行分析。实验中建立了两条标准曲线，并据此确定全部12种分析物的浓度。图中展示了利用流式细胞仪的Express模式进行分析及计算特异性分析物浓度的代表性数据输出结果。柱状图及附带表格显示了12种效应分子的计算浓度（皮克/毫升）。 请点击此处查看该图的放大版本。

CAR T细胞在抗原特异性刺激下的细胞因子分泌动力学

在CAR T细胞与表达（Antigen⁺）或不表达（Antigen⁻）相应抗原的靶细胞共培养后，通过多重检测法的人类细胞毒性检测试剂盒随时间监测细胞因子的分泌情况。CAR T细胞在识别Antigen⁺靶细胞后迅速且强烈地释放细胞因子，在8–24小时内Granzyme B、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-2显著上调，并在48小时达到峰值（图4）。该模式表明，在抗原结合后，CAR T细胞被有效激活并发挥细胞毒性效应功能。IL-6、IL-17A和IL-21也出现中等程度升高，而IL-4、IL-10、MCP-1和Perforin则保持在较低水平或仅有轻微上升。相比之下，与Antigen⁻靶细胞共培养时，所有检测指标的细胞因子诱导均极微弱（图4）。综上所述，这些数据表明CAR T细胞的活化及效应细胞因子的产生是特异性响应抗原识别的结果，并随时间逐渐增强。

图 4： 嵌合抗原受体（CAR）T细胞与抗原阳性或抗原阴性靶细胞共培养时效应分子的分泌动力学。 将经基因工程改造的嵌合抗原受体（CAR）T细胞分别与表达（Antigen⁺）或不表达（Antigen⁻）相应CAR T细胞抗原的靶细胞共培养4、8、16、24和48小时。在每个时间点收集培养上清液，并使用多重检测法中的细胞毒性检测试剂盒对多种可溶性效应分子进行定量分析。图中显示了12种细胞因子的动力学变化（单位：皮克/毫升）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

采用多重检测方法分析CAR T细胞共培养体系中可溶性免疫介质的反应。与抗原阳性靶细胞共培养的CAR T细胞显示出IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、颗粒酶B和IL-2分泌增加，符合效应细胞活化及细胞毒功能的特征^4,5,8。相比之下，抗原阴性对照组细胞因子产生水平较低，表明该检测方法能够在所测试条件下区分抗原特异性反应^5,8。这些结果支持该检测方法在评估CAR T细胞功能方面的适用性，包括用于效力相关分析、安全性相关谱型分析以及作用机制研究。

尽管固定的12种分析物检测面板可全面概述CAR T细胞的免疫活性，但在所有应用中检测全部分析物可能并不实际。对于CAR T细胞产品的检测验证或质量控制（QC）等特定工作流程，可将该面板缩减为较小的子集（例如IL-2、IFN-γ和TNF-α），以简化分析过程，同时保持功能敏感性^1,2。

该实验方案的关键步骤包括CAR T细胞共培养的设计以及采样条件的适当选择。特别是，共培养时间及效应细胞数量（E:T比值）直接影响细胞因子的释放水平，应在建立检测方法时予以明确^5,6。此外，应调整样本稀释倍数，以确保分析物浓度落在检测方法的动态范围之内^1,2。因此，问题排查应重点验证标准曲线的性能，并在信号超出可定量范围时调整共培养条件或稀释因子^1,2。

与传统的单重ELISA相比，基于流式细胞术的多重检测平台能够利用极小的样本体积生成高密度、多分析物的数据集。通过在单一样本中同时检测多种分析物，多重检测技术可减少总体试剂消耗，提高样本通量，并缩短检测时间，相较于进行多个单重检测具有明显优势^1,2。自动化采集和标准化分析选项有望降低操作者依赖性变异，支持在不同实验或生产环境中实现可重复性和可扩展性^5,8。标准ELISA的检测灵敏度通常在16至2000 pg/mL之间（高灵敏度试剂盒可更低）⁷。在本研究所述平台中，最低可检测浓度范围从最敏感分析物的0.05 pg/mL到固有检测灵敏度较低分析物的大约93.8 pg/mL。根据内部评估结果，超过74%的检测分析物的检测限低于5 pg/mL，38%的分析物可在1 pg/mL以下被检测到，凸显了该系统的整体高灵敏度。由于多重检测的灵敏度可能因细胞因子而异，潜在的表位竞争仍是一个重要考虑因素。为尽量减少此类干扰，该检测采用非重叠表位分别用于各分析物的捕获与检测，从而降低由竞争引起的偏差，提升在多重条件下的测量可靠性。

多重检测的性能可能因分析物而异，取决于检测的灵敏度和生物学背景；在某些条件下，分析物浓度可能接近检测上限，因此应在检测建立过程中进行评估。相反，某些分析物（例如本研究中的 MCP-1 和 IL-4）可能因实验条件不同而无法被检测到。此外，分析前因素（如样本处理）可能影响细胞因子的测定结果，应保持一致的样本处理条件以确保结果的可比性。

总体而言，这种多重检测方法能够高效且定量地表征CAR T细胞的功能特性。与大多数现有的多重细胞因子检测平台相比，该检测方法适用于标准流式细胞仪，并配备配套的仪器软件工具，有助于简化数据采集与分析流程。尽管多重细胞因子检测已在其他免疫研究场景中应用，但本研究展示了其在标准化工作流程中用于CAR T细胞功能谱分析的具体应用。基于微球的检测格式可实现多种分析物的同步检测，相较于单重检测方法具有更高的通量。潜在应用包括对药物产品的功能评估，例如CAR结合域评价、载体优化以及工艺开发。该检测方法的可扩展性及自动化分析能力还支持效价测试、安全性评估以及旨在理解CAR T细胞行为与功能的机制性研究^5,7,8。

尽管细胞因子分泌谱可为CAR T细胞的活化状态和功能强度提供有价值的见解 体外，它们无法完全模拟决定患者治疗效果的复杂生物学因素。这些因素包括肿瘤微环境、抗原密度、免疫调控以及 在体 持久性等因素的影响超出了在受控实验中可测量的范围^6,8,10然而，建立可靠且标准化的功能检测方法，例如多重细胞因子分析，是实现药物产品功能表征的重要一步^3,4细胞因子模式不仅可提示CAR T细胞的活性，还与包括细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）在内的毒性现象密切相关。^3,6,7目前，测量方法和报告限值的差异影响了不同试验之间的可比性，凸显出建立标准化、可重复的免疫介质谱分析方法的必要性^1,2,3随着分析技术和临床数据集的不断进步，最终目标是确定能够可靠反映治疗潜力和患者安全性的预测性分泌特征，从而弥合临床前效价检测与临床疗效之间的差距。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人源MACSPlex细胞毒性T/NK细胞检测试剂盒	Miltenyi Biotec	130-125-800	基于微球的多重细胞因子流式检测方法
MACSPlex InspectoR分析工具	Miltenyi Biotec	\	用于MACSPlex数据自动化设门与分析的网络工具
MACSQuant Analyzer 10流式细胞仪	Miltenyi Biotec	130-096-343	用于多重数据检测的流式细胞分析仪器
MACSQuant Analyzer 16流式细胞仪	Miltenyi Biotec	130-109-803	用于多重数据检测的流式细胞分析仪器
MACSQuant Express模式	Miltenyi Biotec	\	用于自动化设门与分析的软件
TexMACS培养基	Miltenyi Biotec	130-097-196	专为培养和扩增人源及小鼠T细胞而优化的无血清细胞培养基