大规模猴脑全脑蛋白质检测的批量免疫染色

此操作流程始于收到经4% PFA灌注、暴露并进行冷冻保护的大脑样本，该样本已送至Neuroscience Associates，利用包埋基质中嵌入的对齐标记进行包埋。可沿冠状面切片，使用特制的篮子和容器获取所需厚度的连续切片，以完整覆盖大脑的前-后轴范围。可通过批量免疫处理，确定目标蛋白在整个大脑中的空间表达模式。

大家好，我是蒙特利尔大学视光学学院视觉神经科学实验室的 Dr. Shaheen Zur。大家好，我是蒙特利尔大学视光学学院视觉神经科学实验室的 Dr. Mark Burke。大家好，我是蒙特利尔大学视光学学院视觉神经科学实验室主任 Dr. Mo Petto。

今天，我们将向您展示一种用于大规模检测完整猴脑中蛋白质的批量免疫染色方法。我们在实验室中使用该方法来研究目标蛋白质在整个脑组织中的表达模式，并比较和对比这些蛋白质在同一脑组织内的表达情况。那么，让我们开始吧。

在进行组织学处理之前，获取一个通过全身灌注保存、后续固定并使用梯度蔗糖溶液进行冷冻保护的灵长类动物脑组织。在此阶段，将脑组织送至神经科学合作机构，利用其专有技术进行包埋并进行自由切片。待样本返回后，可观察到包埋基质中已放置七个对齐标记点，以便在组织学处理完成后对切片进行准确定向和重新对齐。

在切片过程中，会采集数字图像，这些图像后续可用于解剖图谱的三维重建。神经科学关联公司对我们的组织进行处理，以获得覆盖全脑的连续50 µm厚的游离冠状切片。处理完成后，我们即可开始对切片进行组织学处理。

开始组织学处理时，我们通常需要处理每种抗体或染色约140张切片。本文将以使用SMI 32抗体处理的少量切片为例演示该技术，SMI 32是一种针对非磷酸化神经丝蛋白的单克隆抗体。在整个操作过程中，使用专用的染色皿和染色篮，可同时高效地处理大量游离切片。

这可以确保所有切片的染色结果一致。第一步是将切片置于含有TRITON X-100和正常马血清的PBS溶液中孵育60分钟。这一步可减少抗体分子的非特异性结合，从而降低背景染色。

接下来，将切片在含有Triton X-100和正常马血清的PBS配制的SMI 32抗体溶液中4℃孵育过夜。次日，用洗涤液洗涤切片三次，每次10分钟，然后在室温下孵育两小时，使用含Triton X-100和正常马血清的PBS配制的生物素化Muse二抗溶液。

经过另外三轮每次10分钟的漂洗后，将切片置于室温下，与生物素偶联的马辣过氧化物酶复合物溶液孵育1小时。最后，再经过一轮漂洗后，将切片放入D-氨基联苯反应液中反应10分钟，使免疫反应性神经元内产生棕褐色沉淀。反应通过取出染色篮并将切片浸入PBS中而终止。

在 PBS 中经过两到三次、每次五分钟的漂洗后，即可使用大型培养皿和极软的画笔，将切片逐一转移到载玻片上进行封片。将切片从 PBS 缓冲液容器中取出，并逐一转移至明胶包被的玻璃载玻片上。随后，将样品置于通风橱中，于次日室温下静置过夜，使其自然干燥。

将切片浸入去离子水中进行漂洗，以去除封片过程中可能残留的盐结晶。随后，载玻片经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，并用Permount封片剂封片。此阶段，载玻片应水平存放约一周至10天，以使封片剂充分硬化。

此后，切片可保存在切片盒中，或通过显微镜进行成像。该方法可获得目标蛋白在整个猴脑中的完整表达谱。此处展示的代表性冠状切片提供了FMRP、new n和SMI 32表达情况的快照。

在同一猴脑中。我们刚刚向您展示了如何在整个大脑范围内完成目标蛋白的批量免疫染色。进行此操作时，重要的是确保所有切片在各种溶液中孵育期间始终处于轻微振荡状态，并且始终保持完全浸没。

此外，在将样本固定于载玻片上时应耐心操作，尽量去除皱褶和折叠，同时不破坏组织的完整性。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。