非人灵长类动物脑组织的制备用于包埋前免疫组织化学与电子显微镜观察

本实验的总体目标是获得用于电子显微镜观察的非灵长类脑组织可靠的包埋前免疫染色结果。该方法有助于回答神经解剖学领域的关键问题，例如特定脑结构中给定神经支配的突触发生率。该技术的主要优势在于，它是一种简单且低成本的标记方法，适用于电子显微镜下特异性神经支配的观察。

首先，将含有目标区域的50微米厚丙烯醛固定的非人灵长类动物脑组织切片转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的12孔板中。在室温下用PBS漂洗游离切片三次，每次5分钟，然后将切片在新配制的硼氢化钠溶液中室温孵育30分钟。孵育过程中轻轻摇动，无需加盖。

30 分钟结束后，吸除硼氢化钠溶液，向每孔中加入 PBS。将培养板置于摇床，剧烈振荡 10 分钟。重复洗涤两次以上，直至无反应气体残留为止。

将切片置于含有2%正常血清和0.5%冷鱼胶原的PBS稀释液中，在室温下轻轻振荡孵育1小时进行封闭。孵育时间结束后，将切片在室温下轻轻振荡孵育过夜，加入一抗溶液。次日，按前述方法洗涤切片后，将切片在室温下加入二抗溶液轻轻振荡孵育一个半小时。

按照之前的方法洗涤切片后，在avidin-biotin-peroxidase或ABC溶液中室温震荡孵育1小时。接着，配制新鲜的DAB显色液：将0.05% 3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-Diaminobenzidine）与0.005%过氧化氢溶于TBS缓冲液中。洗涤切片后，将切片置于DAB溶液中，轻轻震荡孵育3至7分钟。

当棕褐色沉淀达到理想颜色后，立即用冷TBS快速洗涤两次以终止反应，随后进行一系列定时的TBS和PB洗涤。将含有DAB染色切片的培养板转移至通风橱中。将切片转移至盛有PB的六孔板中，通过小心吸去PB缓冲液使切片完全展平，然后逐滴加入四氧化锇溶液，避免扰动已展平的切片。

用铝箔覆盖载片，以保护切片免受光照，并在室温下静置孵育30分钟，期间不进行振荡。在锇酸固定过程中，通过将环氧树脂混合物的各组分按适当比例加入一个大塑料杯中，配制疏水性环氧树脂。用木棒或塑料移液管搅拌，直至形成均匀的棕色溶液，然后将等量树脂转移至适当大小的铝杯中（铝杯数量需与待处理切片数量相匹配），并静置备用。

锇酸固定时间结束后，用磷酸缓冲液（PB）以低速振荡洗涤切片三次，每次10分钟。洗涤后，将切片依次浸入梯度乙醇溶液中脱水，每级乙醇处理2分钟。随后，将切片转移至装有丙酮氧化物的玻璃小瓶中，再用丙酮氧化物孵育三次，每次2分钟，以完成脱水过程。

然后将切片逐个小心转移至铝杯中，尽量避免与空气接触。将切片平埋于预先混合好的防水环氧树脂中，并在室温下于通风橱内孵育过夜。次日，用矿物油涂抹载玻片和塑料盖玻片，随后将铝杯置于60摄氏度下孵育最多12至15分钟，以软化树脂。

将切片小心地展平在涂有润滑剂的载玻片表面，盖上涂有润滑剂的盖玻片，并轻轻推挤以排出残留的空气。将载玻片置于 60 摄氏度下孵育 48 小时。

48小时后，移除塑料盖玻片，使切片仍包埋在树脂中。首先使用双目镜定位目标区域，然后用解剖刀切割出一块约一平方毫米的微小四边形组织。接着，将树脂块的尖端修平，再将四边形组织块粘附其上。

干燥后，将树脂块垂直放置于超薄切片机的载物台上，使用锋利的剃刀逐步切割树脂块的两侧，形成侧面光滑的梯形。接着，将载物台转至水平位置，并旋转树脂块，使梯形的最长边朝下。将金刚石修块刀具或玻璃刀置于指定位置。

将超薄切片机设置为以每秒一毫米的速度切割300微米的切片。调整刀片，使其与四方形组织块垂直平行，并呈现约一度的微小水平角度，修整四方形组织块表面，直至组织开始显露。随后，更换为装有蒸馏水舟的45度超薄金刚石刀，用于切割80微米厚的切片。

用浸过二甲苯的吸水纸轻轻擦拭切片表面（不要接触水面）以展平切片，并将连续切片收集到裸露的150目铜网上。将铜网放入网格储存盒中，然后配制一份柠檬酸铅储备液与蒸馏水1:1的混合溶液，并通过0.2微米注射器滤器过滤。用铝箔包裹试剂瓶以避光。

将每张载网置于一滴稀释的柠檬酸铅溶液上，使切面与溶液接触。然后用小镊子夹住载网，在两个盛有蒸馏水的烧杯中彻底冲洗。用吸水纸轻轻吸去多余水分，将载网放入载网盒中。30分钟后，可用透射电子显微镜观察切片。

这幅松鼠猴内侧苍白球的电子显微照片显示，在经心内灌注丙烯醛-多聚甲醛固定后，采用免疫过氧化物酶二氨基联苯胺技术处理，组织保存良好。如图所示，该方法可清晰观察到由箭头指示的大轴突的髓鞘结构。这幅外侧苍白球的电子显微照片展示了树突轮廓（以字母 d 标示）、小的无髓轴突（以 a 标示）以及轴突曲张体（以 av 标示），这些结构均可被清楚识别。

箭头显示了一个轴突曲张体与树突轮廓形成对称性突触接触的示例。免疫标记的结构可通过其细胞质或轴浆内充满电子致密的DAB沉淀物而轻松识别。在此处，来自未标记轴突曲张体的突触接触投射到苍白球内侧部（GPi）中胆碱乙酰转移酶免疫染色阳性的树突上。

该电子显微照片显示了苍白球外侧部（GPe）中一条具有相对完整髓鞘的有髓轴突，其轴浆内酪氨酸羟化酶免疫标记阳性。此示例显示了一条在苍白球内侧部（GPi）内5-羟色胺转运体免疫标记阳性的轴突曲张体，该曲张体与一条树突形成对称性突触接触。在此示例中，DAB沉淀物沿质膜以及细胞器的外表面分布。

此处所示的轴突曲张体是在苍白球外侧部（GPe）中观察到的，并进行了酪氨酸羟化酶的免疫标记。该图像展示了DAB沉淀物完全充满轴浆的一个实例，其中突触小泡可见但较难分辨。完成此操作后，可进一步采用其他方法，如包埋前双重免疫组织化学技术，以回答更多问题，例如在突触水平上蛋白质或受体的共定位情况。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何对非灵长类动物脑组织进行包埋前免疫组织化学处理，随后将其包埋于环氧树脂中，并将目标区域超薄切片至80微米厚度，以适用于电子显微镜观察。