通过移植生成嵌合体斑马鱼胚胎

大家好，我是来自塞西莉亚·欧文斯实验室的希拉里·肯普。这位是塞西莉亚·欧文斯。我和希拉里都在西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心的基础科学部工作。

今天我们将向您展示一种制备嵌合型斑马鱼胚胎的技术，也称为遗传嵌合体。该方法使我们能够评估基因功能在发育过程中的细胞基础。我们可以探究特定基因的作用是发生在具有突变表型的细胞内部（即细胞自主性功能），还是发生在这些细胞所处的环境之中（即细胞非自主性功能）。

我们通过在囊胚期或早期原肠胚期将细胞在野生型与突变型胚胎之间移植来制备这些嵌合体。随后，通过观察供体来源细胞在宿主环境中的表型和基因型来评估基因功能。现在让我们开始吧。

在本实验步骤中，将谱系示踪染料注入供体胚胎，以便在移植后追踪供体来源细胞的命运。也可利用该技术注射多种类型的核酸，但若在操作胚胎前注射DNA，则省略染色步骤。在开始工作前，通过将一块载玻片以45度角插入培养皿最宽处，制备注射用培养皿，皿中加入含青霉素-链霉素的1.2%琼脂胚胎培养基，加至培养皿容量的四分之三满。

在农杆菌凝固后取出载玻片，形成斜面槽。用含青霉素-链霉素的胚胎培养基填充斜面槽。随后开始对单细胞期胚胎进行酶解处理。

将处于单细胞阶段的胚胎在0.5毫克/毫升的蛋白酶溶液中孵育1至5分钟。密切观察去壳过程。

一旦观察到绒毛膜开始明显塌陷，立即将胚胎浸入系统水中，此时所有绒毛膜都会被冲走，而胚胎则停留在弯头底部。至关重要的是，胚胎不能再接触水面一次，此时大多数胚胎的绒毛膜已经脱落。仍有少量胚胎在外部旋转，其绒毛膜尚未脱去。

如果任何胚胎仍处于其卵膜内，则通过如此移液操作可使其脱离卵膜，从而释放胚胎，使其不会接触水面。操作包被的胚胎时，必须使用经过火焰抛光以使边缘光滑的移液管。使用宽口火焰抛光玻璃移液管，轻柔地将脆弱的去壳包被胚胎转移至注射培养皿的槽中。

然后将单个文件加载到此槽中。现在，胚胎已准备好使用经过精确校准的火焰拉制玻璃注射毛细管和压力注射装置注入谱系标记物。我们将使用一皿充满胚胎培养基的器皿来打断针尖，另用一皿充满油的器皿来校准针尖。

这仅是一种常规的标准实验室级矿物油。我们取一把锋利的钟表匠镊子，在通过目镜观察以确定合适尺寸的同时，将镊子置于针头两侧，然后轻轻折断芯片。如果不通过观察，我实际上无法完成这一操作。在开始之前，需确定所递送染料或核糖核苷酸的体积。

在矿物油培养皿中测量液滴体积。应折断针头，使微量注射器脉冲一到两次即可递送一纳升的液滴。可通过目镜测微尺测量液滴直径，并据此计算其体积。

在包被胚胎的一细胞期至四细胞期之间，将一纳升浓度为1%至3%的荧光葡聚糖溶液直接注入卵黄中。我将把胚胎置于针尖正下方，轻轻将针头插入卵黄中心，然后踩下脚踏板。

注射时，必须将染料注入卵黄流中，以确保染料被运输至细胞内。该注射足以在嵌合胚胎发育的数天过程中追踪细胞。理想情况下，我们应在细胞达到四细胞期之前完成注射，并将注射后的胚胎置于含新鲜青霉素-链霉素胚胎培养基的包被培养皿中，以低密度培养。

请注意，注射后的胚胎发育速度通常稍慢，因此将胚胎分别置于25、28和31摄氏度下培养，以错开发育时相，从而延长可进行移植操作的时间窗口。斑马鱼囊胚期细胞移植所用装置由一个由驱动装置控制的Hamilton注射器组成，该注射器通过一段柔性管路连接三通旋塞，分别与矿物油储液器和显微注射针持针器相连。务必排除系统中的所有气泡，因为气泡会影响对吸力和压力的控制，导致操作失败。

使用具有高质量光学元件的体视显微镜，放大倍数至少为 DX。为控制微量移液器支架和针头的位置，建议使用 NARA shige 手动显微操作器。务必通过磁性底座将其固定在实验台上，以防止振动传递至移植操作。

针移植所用的针由玻璃毛细移液管制成，需在电极拉制仪上拉成平缓的锥形。有关在解剖显微镜下拉制移液管并折断其尖端的具体操作，请参见 Miriam Goodman 实验室的 JoVE 方案。对于囊胚期的移植，针的外径应约为 50 至 60 微米；而对于原肠胚期的移植，则应为 30 至 40 微米。

为了改善胃部注射时的穿透效果，在微锻炉上首先需要用微锻炉将针尖末端拉出一个锋利的倒钩，通过将针尖靠近微锻炉的加热丝来使针尖变光滑。然后旋转针头，使针斜面的前缘接触加热丝。一旦针的前缘接触到加热丝，迅速将其拉开，以形成倒钩。

为避免损伤细胞，针尖应保持平直，且针头末端不应弯曲。在准备好显微操作装置和移植针后，即可开始制备嵌合胚胎。囊胚期移植适用于在不需要精细命运图谱信息时，将细胞在胚胎之间进行移植。除原始生殖细胞外，大多数细胞在此阶段通常尚未决定其发育命运。

囊胚的命运图谱使得我们能够区分将发育为外胚层的细胞和将发育为中胚层的细胞。中胚层和内胚层的前体细胞位于囊胚期胚胎的边缘附近，而将发育为神经系统和表皮的外胚层前体细胞则位于距离胚胎边缘较远的位置。因此，当我们向囊胚期胚胎移植细胞时，可以将这些细胞精准地植入预定中胚层或预定外胚层区域。

但我们无法将细胞靶向到外胚层或中胚层的任何特定区域，因为我们尚不清楚。在囊胚期，胚胎的背侧位置尚未明确。提前准备好注射用培养皿：将带有成对楔形突起的塑料模具漂浮在已注入一半熔融的含有1.2%琼脂糖的胚胎培养基的培养皿中。待琼脂糖凝固后，移除模具，留下若干排三角形小孔，每个小孔的大小恰好可容纳一个胚胎。

用青链霉素胚胎培养基填充移植模具，使用火焰抛光的玻璃移液管将囊胚期胚胎逐个加入每个孔中。随后将胚胎转移至移植孔中，最初使其侧向放置。排列胚胎时，将供体胚胎放置在一列，受体胚胎放置在相邻的一列。

将培养皿放置在载物台上，使得移植针进入胚胎时，针头能将胚胎推向其所在孔的后壁。使用显微操作仪，以较陡的角度将移植针下降至培养皿中。理想情况下，移植针应以约45度角进入胚胎。

当针尖进入胚胎培养基表面以下后，通过旋转控制汉密尔顿注射器的微米驱动装置，将少量胚胎培养基吸入针内。为了实现最精确的控制，矿物油与胚胎培养基的界面应保持在针头细锥形部分，不宜过于接近针尖。用针轻轻定位供体胚胎，然后将针回撤，并在所需位置刺入胚胎的囊胚帽区域。

快速而有力地刺入可穿透胚胎，同时避免其发生滚动。缓慢而小心地将供体细胞吸入针头，以避免细胞受到剪切损伤。在吸入所需数量的细胞后，避免将卵黄吸入针头内。

轻微反转压力以停止抽吸，并将针头从宿主胚胎移开以使其到位。通过移动移植培养皿，可利用移植针轻轻转动宿主胚胎，从而对其位置进行微调，但需注意避免触碰卵黄。将供体细胞注入宿主胚胎时，应避免将卵黄吸入胚胎内，否则会损伤并杀死供体细胞。单个供体胚胎的细胞可在完成细胞转移后移植至多个宿主。

将供体与受体配对转移到24孔板的包被孔中继续培养。囊胚期细胞通常未定向特定命运，但原始生殖细胞是一个例外。原始生殖细胞在发育早期即被确定，并已定向为原始生殖细胞的命运状态。

在发育的很早期，原始生殖细胞位于囊胚和原肠胚阶段胚胎的边缘附近。因此，如果移植实验的目标是移植原始生殖细胞，那么供体胚胎中细胞的来源位置非常重要，而细胞在宿主胚胎中的移植位置则不重要。因此，其原则是：对于体细胞而言，它们在宿主胚胎中的迁移位置将决定其命运，这一点至关重要。

对于原始生殖细胞而言，它们在供体胚胎中的来源位置非常重要，因为其命运已经确定。如果目标是移植原始生殖细胞，则必须从供体胚胎的边缘区域获取这些细胞。在该发育阶段（即囊胚期或高阶段），这些细胞位于胚胎边缘附近，呈四个小簇分布，每簇由三到四个细胞组成。操作时必须格外轻柔地拾取这些细胞，以避免意外吸入卵黄。

好的，我刚刚已完成上述操作，现在将转入宿主胚胎。原始生殖细胞会自行迁移并定位于所在胚胎的生殖嵴区域，因此无需将这些原始生殖细胞移植至边缘部位，它们会自主到达目标位置。

因此，我只是将它们重新移植回原肠胚的任意位置。生殖细胞移植的关键——与其他类型的移植截然相反——在于供体细胞的来源位置。将细胞移植到原肠胚期的受体中，可使实验者利用斑马鱼命运图谱，该图谱在胚胎盾结构变得可见时即显现出来。

可以区分不同的组织类型以及预定中枢神经系统内的各个区域。在原肠胚阶段的胚胎之间进行细胞转移时，实验方案存在一些变化，但总体步骤与将囊胚固定在载玻片上进行操作类似。首先，用移液管在玻璃凹面载玻片的凹槽内涂抹一条垂直的甲基纤维素条带，然后使用经火焰抛光的移液管加入足量的含青霉素-链霉素的胚胎培养基。

选择一个供体和三个处于盾片期的宿主进行移植操作。供体胚胎应略早于宿主胚胎。需要使用一种新工具来操作胃部胶状物，即将一段短的2磅拉力钓鱼线的末端插入毛细管的末端。

从而形成一个小环。用该环轻轻将供体和受体胚胎卷起，移至甲基纤维素条的顶部，并将其推入甲基纤维素中直至固定。滚动胚胎使其定位，使目标区域朝上。

由于在移植过程中，针头需以切线方向进入胚胎，将供体细胞注入而不损伤卵黄。胃泡期的移植最好在固定阶段的复式显微镜下进行。使用显微操作仪的控制装置，将移植针的尖端调至焦点位置。

将微量移液器支架和针头置于较浅的角度，使针头尽可能接近水平，但需以载玻片凹槽边缘允许的范围为限。接着刺入供体胚胎。如果胚胎固定得当，在移植针进入时不会发生滚动，除非胚胎过于成熟，导致针头难以顺利穿透。

为避免刺破卵黄，针头应进入略深于EDL焦平面的胚胎位置。一旦刺入，可从供体中取出大量细胞，供最多三次宿主细胞注射使用。吸取细胞时，若需要，可在吸取细胞的同时移动针头，避免吸入卵黄。

在将细胞注入宿主胚胎之前，可使用同一根针收集更多胚胎以获取额外细胞；在将细胞注入宿主胚胎时，应在针头穿过靶区域的过程中逐出细胞，而不是将细胞集中沉积为单一团块。此操作可提高供体细胞贡献于目标组织的可能性。完成细胞移植后，将整个载玻片放入培养皿中，并小心地用青霉素-链霉素胚胎培养基淹没。

在接下来的几个小时内，甲基纤维素将逐渐溶解，释放出胚胎。移植的细胞数量取决于实验的具体目的。单个供体的细胞可在移植后的第二天早晨移植到三至四个受体中。

可通过检查受体以确定供体细胞的靶向移植是否成功。将囊胚期的原始生殖细胞成功移植后，可在卵黄与卵黄延伸部分交界处的腹侧观察到荧光标记的细胞。至此，我们已向您展示了如何进行原肠胚期和囊胚期的移植操作。

进行该技术操作时，为希望靶向的组织选择合适的移植方法至关重要。例如，囊胚期移植足以确定细胞是进入中胚层还是外胚层。此外，您还可以利用该技术靶向原始生殖细胞。

如果希望进行更精细的定位，最好采用胃期移植技术，此时胚胎的背侧已确定。利用该技术，可将细胞靶向移植至神经系统的不同区域，特别是前脑、中脑、后脑以及脊髓。以上就是全部内容。

非常感谢您的观看，祝您所有实验顺利成功。