一种可同时原位可视化病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染细胞的技术 In situ

通过结合原位杂交与四聚体染色技术（称为ISTH），可确定病毒抗原特异性免疫效应细胞与病毒感染的细胞及组织之间的相对数量和空间关系。ISTH首先将新鲜的SIV感染组织包埋于琼脂糖中，随后使用振动切片机将组织切成200微米厚的切片，并对病毒抗原进行染色。

使用FITC标记的MHC四聚体检测特异性CD8+细胞。冷冻后，利用恒冷箱将这些染色组织进一步切成8 µm厚的切片，并进行原位杂交以定位病毒感染的细胞。采用共聚焦显微镜对双重染色切片进行成像，最终重建原始的厚切片，以揭示免疫效应细胞与靶细胞之间的关系。

采用此方法检测早期SIV感染已被证明可有效预测后续疾病的严重程度。大家好，我是明尼苏达大学微生物学系Ashley Ha实验室的Chinen Lee。我是明尼苏达大学兽医生物医学科学系的助理教授Pam Skinner。

今天我们将向您展示一种在研究所内进行原位杂交的方法，简称ISTH。除了今天演示的使用原位四聚体染色（inci teer staining）与原位杂交（inci hybridization）相结合的方法外，我们还常规采用原位四聚体染色与免疫组织化学相结合的技术，以原位确定抗原特异性CD8+ T细胞的位置、丰度及其蛋白表达谱。今天协助我们完成厚切片原位四聚体染色的是Heon Kim博士和Terry Matala，协助我们进行薄切片制备及原位杂交的是。现在让我们开始吧。

开始此操作前，将含有无菌 PBSH 的 Vibram 浴冷却至接近 2 摄氏度。将振动刀片角度设置为 27 度。在可能的情况下，始终将新鲜组织置于冰上保持低温，并在组织收获后 24 小时内开始操作。

为了尽量减少冷缺血造成的组织降解，使用振动切片机（vibram）也有助于切割新鲜组织：先去除结缔组织，再用解剖刀将组织切成小块，将组织块放入载蜡槽中，并用4%低熔点琼脂糖（Agros）覆盖，该琼脂糖在PBS中溶解，溶解温度约为40摄氏度。确保组织与培养皿底部充分接触，若组织块漂浮，需将其压下，随后在冰上固定3至5分钟。

此处使用脾脏组织，但也可使用淋巴结、阴道、宫颈、子宫或其他新鲜组织，并用手术刀进行操作。用手术刀切除组织周围的琼脂糖块，然后用镊子小心地将嵌入琼脂糖的组织转移至组织块上。接着，用Loctite胶水涂覆Vibram组织块。

一旦将组织块放置在组织块上，就不要再移动。在冰上干燥约10分钟。接着，将组织块安装到振动切片机上，使用极慢的前进速度和相对较高的振幅，将组织切成200微米厚的切片。

使用画笔将切好的组织切片转移至置于24孔细胞培养板孔内的专用组织孵育腔中，每个孔预先加入1毫升预冷的PBSH。每个组织孵育腔中可放入最多四个组织切片。标记样品，并用橡皮筋将盖子固定在培养板上，以进行针对病毒特异性T细胞的染色。

将ZI偶联的四聚体首先用封闭缓冲液稀释至每毫升约0.5微克。将该溶液以每孔1毫升的量加入24孔板中。将新切的组织转移至板内的组织腔室中，并在4摄氏度下轻轻振荡孵育过夜。

在含有不同样本的组织腔室之间保留一个空的腔室，以防止后续步骤中溶液的交叉污染。在此步骤中，可加入针对细胞外或细胞表面蛋白的抗体。洗涤时，在初次孵育后，准备一个含有预冷 PBSH 的 24 孔组织培养板用于洗涤。

每次将组织腔室转移至预装好的培养板中，用 PBS 缓冲液清洗两次，每次 20 分钟。转移前务必排干组织腔室中的大部分液体。移动组织腔室时，避免将一个样本的内容物滴入另一个样本中，并观察组织腔室内的切片，确保其未粘附在腔室侧壁上。固定后，在室温下用新鲜的 4% 多聚甲醛 PBS 溶液固定切片两小时。

用冷的PBSH洗涤两次，每次五分钟，以放大四聚体信号。将切片与兔抗fitzy抗体在封闭缓冲液中以1:10,000的比例于4℃孵育一至三天。在此阶段，可加入针对细胞内表位的抗体。

在添加抗体之前，务必对细胞进行透化处理，并封闭非特异性结合位点。在第二次长时间孵育（旨在扩增信号）之后，可能还需要进行抗原修复。每次用 PBSH 洗涤切片，至少 20 分钟，可长达数小时，共洗涤三次。

使用适当的荧光标记抗体进行最终孵育。例如，可使用山羊抗兔SI3抗体结合兔抗fitzy抗体，使四聚体染色的细胞呈现红色荧光。若使用小鼠抗体对感兴趣蛋白（如CD8）进行复染以可视化杀伤性T细胞，则可使用山羊抗小鼠Alexa 488抗体结合小鼠抗体，使抗体染色的细胞呈现绿色荧光。每种抗体的稀释比例需通过实验确定。

孵育一至三天，在此期间及之后用锡箔纸包裹培养板以保护切片免受光照，因为光照会淬灭荧光。最后再次固定切片，以确保四聚体和抗体牢固结合。洗涤后，用含有4毫克/毫升对苯二酚（N-propyl gallate）的明胶甘油封片剂将切片封固于载玻片上，于-20 °C保存，直至进行原位杂交前制备薄切片。

现在可以使用共聚焦显微镜分析原位四聚体染色切片，以确定抗原特异性CD8+ T细胞在组织中的定位、丰度及蛋白质表达模式。图中所示为SIV感染的猕猴脾脏组织切片，使用gag四聚体染色标记SIV特异性CD8+ T细胞，并用CD20抗体和CD3抗体进行染色。由于后续步骤中抗体的复染信号将会丢失，因此在继续下一步之前，必须先完成对原位四聚体的分析。

通过将200微米厚的切片置于加热块上于70摄氏度加热五分钟，开始薄切片程序，以使厚切片从载玻片上脱落。切片脱落后，将其包埋于OCT中并置于干冰上：首先在塑料模具底部填充OCT，然后将组织置于OCT之上，并用OCT覆盖组织。

使用冷冻切片机从OCT包埋的组织中切下8 µm厚的切片，并将8 µm切片贴附至硅化载玻片上。切片随后可置于密封盒中，于-80 °C保存，以备后续进行原位杂交。采用标准原位杂交方法，利用³⁵S标记的病毒特异性核糖探针检测病毒感染的细胞。

该步骤还包括用核径迹乳胶包被切片并封片。使用配备反射蓝光管装置的 BioRad MRC 1000 共聚焦显微镜，在与荧光兼容的封片介质中获取共聚焦图像。原位四聚体染色通过 EPI one 605 检测红色四聚体荧光染料，以及通过 EPI 2 522 DF 32 检测绿色 CD8 荧光染料，用于原位杂交。

使用EPI双蓝反射来观察在放射自显影中由原位杂交信号产生的银颗粒。开始图像采集时，应从每张切片的左到右、上到下依次采集图像，并确保每幅图像与其相邻图像之间有约20%的重叠。为避免重建的拼接图像中出现间隙，应在Excel文件中根据图像的行和列对每幅图像进行命名。

当载玻片的数据采集完成后，使用共聚焦辅助软件，通过作者提供的Photoshop七步操作程序，将每个通道的Z轴序列图像投影为单个图像，并自动将三个通道的投影图像合并为一个RGB图像。然后将合并后的图像分层拼接，生成整个切片的拼合图像。使用Metamorph或Photoshop将单个银颗粒和四聚体染色与拼合图像中的细胞对应起来。

为病毒RNA阳性细胞和四聚体阳性细胞的中心或OID分配XY坐标。将OID数据以每个细胞的数值形式导出至Excel文件，并利用Excel文件中收集的数据，根据切片中四聚体阳性细胞与病毒RNA阳性细胞的总数，确定免疫效应细胞（E细胞）与病毒靶细胞（T细胞）的比例，以捕捉四聚体阳性细胞与RNA阳性细胞之间的空间关系。从Excel文件中复制各自的图表并粘贴到Photoshop文档中。

降低图层的不透明度，以对齐和缩放网格，使其颜色重合，选择后复制并粘贴到新图层中。丢弃用于对齐网格的图层后，蓝色RNA阳性细胞以及四聚体阳性与病毒RNA阳性细胞的位置将在合并后的图像中显现。通过此处展示的ISTH方法，我们能够追踪SIV感染在阴道内接种后于该入口部位及感染扩散所及的淋巴组织中的免疫应答过程。

感染后10天，这些组织部位存在大量感染细胞，但即使到了三天后，仍仅有绿色染色的CD8阳性细胞，尚未出现红色染色的SIV特异性四聚体阳性细胞。因此，免疫反应出现过晚，无法清除感染。

然而，在感染后三周，感染细胞的数量明显减少，尤其是在入侵门户处。我们采用 ISTH 方法显示，这种减少的程度与四聚体阳性免疫效应细胞的空间 proximity 及相对数量相关。N-S-I-V-R-N-A 阳性的靶细胞，我们称之为体内 E 与 T 的比值（E:T 比值）。

通过该方法，可轻松可视化此感染淋巴结中效应细胞（红色）与病毒靶细胞（蓝色）之间的空间关系。许多效应细胞与靶细胞彼此靠近，某些区域可见多个效应细胞围绕单个S-I-V-R-N-A阳性细胞，而其他区域则可见S-I-V-R-N-A阳性细胞单独存在。当细胞位置被确定并记录在Excel文件中时，E:T比值可直接根据各类细胞的数量计算得出。

对病毒感染的最佳控制与红色效应细胞相对于绿色靶细胞的显著过量相关，比例达到43比1。在此情况下，在感染起始部位——宫颈和阴道中的ETT比值低于淋巴结中的比值。高ETT比值与病毒载量从峰值下降之间存在正相关关系，表明在感染入口处更强烈的免疫反应可转化为对感染更有效的控制。

我们刚刚向您展示了如何在原位同时检测特异性的 CDAT 细胞和病毒感染细胞。该技术使我们能够在组织中同时观察抗原特异性 T 细胞和病毒感染细胞。在进行此操作时，该技术可用于评估基于 CD8 阳性 T 细胞的疫苗以及其他非病毒病原体与宿主之间的相互作用。

在进行杂交实验之前，保持所有试剂无RNA酶污染非常重要。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。