单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

我们基于细胞的多重免疫荧光检测DNA、RNA和蛋白质的方法，能够同时在单个细胞内可视化不同类型和链结构的蛋白质与核酸。铺板前，将盖玻片在乙醇中孵育5分钟，随后用PBS洗涤两次，每次2分钟。第二次洗涤后，将盖玻片完全浸入含20微克/毫升多聚-D-赖氨酸的溶液中，室温孵育30分钟。

孵育结束后，用 PBS 洗涤两次以去除多余的基质溶液，并将目标细胞稀释至每张盖玻片浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/50 µL PBS。随后，将 50 µL 目标细胞接种到每张经多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上，在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞三次，然后用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟。

孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞两次，然后在室温下用含有 0.1% Tween 20 的 500 微升 PBS 溶液对细胞进行透化处理，持续 10 分钟。孵育结束后，每次用 500 微升新鲜 PBS 洗涤盖玻片，共洗涤两次。为了将盖玻片固定在载玻片上，先在已灭菌的载玻片上滴加一滴透明指甲油，将盖玻片无细胞的一面边缘接触指甲油液滴，然后缓缓将盖玻片放下，使细胞面朝上贴附于载玻片。

向固定的盖玻片上加入几滴 PBS，以防止细胞脱水，并使用疏水屏障笔在盖玻片外围画一圈。画好屏障后，将 PBS 替换为 100 微升蛋白酶 III，将载玻片置于 40 °C 培养箱中孵育 15 分钟。孵育结束后，用新鲜 PBS 摇动洗涤载玻片两次，每次洗涤 2 分钟。

第二次洗涤后，在67摄氏度下，将感兴趣的探针用200微升杂交缓冲液稀释10分钟。孵育结束后，向每张盖玻片加入50微升探针溶液，并将载玻片置于湿润的40摄氏度烘箱中孵育2小时。孵育结束后，用新鲜洗涤缓冲液振荡洗涤载玻片两次，每次洗涤2分钟。

第二次洗涤后，轻敲玻片以去除多余的缓冲液，并依次在盖玻片上各加一滴荧光通道1、2和3的扩增剂，在40摄氏度下每种扩增剂孵育30分钟，每次扩增剂处理之间用新鲜洗涤缓冲液在摇床上洗涤两次，每次两分钟。最后一次洗涤后，在盖玻片上加一滴荧光通道4的扩增剂，在40摄氏度培养箱中孵育15分钟，随后用洗涤缓冲液洗涤两次，再用PBS洗涤一次，操作如前所述。对于目标蛋白的免疫染色，在最后一次洗涤后，每张盖玻片加入200微升封闭缓冲液，在室温下孵育一小时。

孵育结束后，倾去封闭缓冲液，加入200 µL用含1%牛血清白蛋白的PBS-Tween 20稀释的一抗。室温孵育1小时后，在新鲜的PBS-Tween 20中振荡洗涤两次，每次10分钟，然后在室温下用合适的二抗孵育1小时以标记样品。孵育结束后，将切片在新鲜的PBS-Tween 20中再次洗涤两次，每次振荡洗涤10分钟。

第二次洗涤后，在室温下用适当的细胞核染料对细胞核复染1分钟，随后在室温下用PBS振荡洗涤两次，每次10分钟。为成像制备样品时，将一滴抗荧光淬灭剂溶液滴加到每个样品对应的新的无菌载玻片上，并将溶液铺展至覆盖面积大约与盖玻片相当的区域。将盖玻片从原载玻片上取下，并浸入PBS中。

使用镊子去除残留的指甲油，并用实验室擦拭纸擦干盖玻片背面。然后将每张盖玻片的样本面向下轻轻放置在抗荧光淬灭溶液上，让样本过夜干燥。作为该实验方案的概念验证，HIV-1 DNA、RNA 和蛋白质在同一细胞水平上被同时标记并进行显微观察。

在此示例中，可以在单个细胞内观察到两个HIV-1 DNA基因组，它们正在主动转录病毒RNA。病毒RNA通过核孔复合体被转运至细胞质，病毒蛋白在细胞质中合成。如所观察到的，尽管使用了两种可能存在探针交叉反应性的逆转录病毒进行标记，但在两种病毒的探针组之间几乎未观察到交叉反应性。

此外，如果在样品制备过程中用RNase处理细胞，可消除病毒RNA染色。随后可定量每幅图像中每个细胞的抗体信号的平均总荧光强度。如所观察到的，HBV前基因组RNA和总HBV RNA的含量随着HBV感染进程而增加。

也可以使用60倍油镜通过共聚焦显微镜对HCV感染进行成像，以检测目标荧光染料。这种高特异性方法还能够以高时空分辨率追踪病毒或细胞过程。此外，该技术可用于研究多种病毒及其他病原体。