活体解剖 黑腹果蝇 胚胎：通过抗体染色快速筛选突变体文库的优化方法

此处展示收集胚胎的操作流程。将果蝇从试管转移到五孔收集室的管中，然后在收集室上方放置一块葡萄琼脂培养基平板，让果蝇产卵数小时。

当胚胎发育至合适阶段时，用画笔将它们从葡萄糖凝胶上转移到双面胶带上。接着将胚胎从其外壳中滚出，并将其腹面朝上排列在琼脂块上。在画面中央，我们看到一张载玻片，上面有一块矩形石蜡和一段双面胶带。将带有排列整齐胚胎的琼脂块倒置，使双面胶带覆盖其上，并轻轻接触胚胎，从而将胚胎转移至载玻片上。

此时胚胎将立即呈背面向上。向载玻片上蜡矩形圈出的区域加入PBS，以浸没胚胎。上方为载玻片的侧面示意图，下方为顶面示意图。

用玻璃解剖针沿卵膜切开一条切口。在胚胎的脑部区域穿刺，将其提起并移至玻璃表面排成行。随后解剖每个胚胎，制成鳍条状标本。

实验步骤结束时，您将获得一张载玻片，上面排列着多行胚胎。现在可以进行固定。大家好，我是 Peter Lee，来自加州理工学院生物系 Kaizens 实验室的一名研究员。

大家好，我是 Ashley Wright，加州理工学院凯曾实验室的研究生。我是凯曾，加州理工学院的教授，我的研究团队致力于果蝇神经系统发育的研究。今天我们将向您展示一种活体果蝇胚胎解剖的操作方法。

我们已利用这些方法寻找孤儿受体的配体。具体做法是，通过受体融合蛋白对过表达细胞表面蛋白的品系进行胚胎活体染色筛选。在实验室中，我们还利用该方法研究胚胎表型并开展遗传筛选。

我已针对运动行为在导向表型上进行了缺陷筛选。现在让我们开始吧。Peter 将向您演示具体操作方法。

首先，使用刮刀将酵母糊点样至与胚胎收集室各桶相对应的葡萄培养基卵收集板上。接着，向果蝇培养瓶中注入二氧化碳气体，使果蝇麻醉。然后将数百只果蝇直接转移至收集室中。

然后用卵收集板盖住培养室，并用一条20英寸长的标签胶带从琼脂板中部开始将培养室和收集板绑在一起，胶带会覆盖到卵收集板上。待果蝇苏醒后，将装置水平放置于避光环境中，在室温下孵育两到三小时。孵育结束后，轻敲使果蝇沉降至底部，然后更换收集板。

若移除的培养皿每个区域中胚胎数量少于100个，则继续进行每两小时一次的收集，直至收集到足够数量的胚胎。所收集的胚胎可根据随附书面实验方案中的要求进行合并。

为了使胚胎老化，将一张湿润的90毫米圆形滤纸放在培养皿盖内，然后将带有胚胎的收集板倒扣在滤纸上。在所需的温度下孵育所需的时间。准备用于胚胎分期和分选的载玻片时，先在载玻片上贴上双面胶带，然后将一块矩形的葡萄琼脂放置在S载玻片上。

孵育容器应足够大，能够容纳5到10行、每行10到15个胚胎。一旦胚胎发育至所需阶段，将其从培养箱中取出。将已老化的胚胎从收集板转移至双面胶带。

用湿润的画笔将胚胎均匀地铺在胶带上。在GFP体视显微镜下观察胚胎，筛选具有适当GFP表达的个体，GFP表达表明其基因型。在本实验中，基因分型通过选择不表达平衡染色体Curly arm上GFP的胚胎来进行。

由于胚胎基因分型会因所使用的平衡染色体不同而有所差异，有关此步骤的详细信息，请参阅随附的书面实验方案。接下来，使用钝头解剖针轻轻在双面胶带上滚动胚胎，以对其进行包埋。在16期，肠道已分化为三条带状结构。

此后，肠道开始在尾部附近形成斜行条带，随后发生盘绕，胚胎结构也变得更加清晰。接着，用解剖针将每个胚胎在卵膜或其他胚胎表面滚动，避免接触胶带，将胚胎提起并转移至葡萄糖琼脂块上。

将包被的胚胎背侧紧贴琼脂板，后端朝下，整齐排列在琼脂板上。然后将载玻片放入含有湿滤纸的培养皿中，在室温下孵育胚胎，直至达到所需发育阶段。进行解剖时，取一小块双面胶带，剪成矩形，用于制备活体解剖载片。用蜡笔将胶带放置在超冻 Plus 载玻片的一端附近。

在蜡带上绘制一个与载玻片同宽、长度为30至40毫米的矩形。蜡与蜡带之间应留出约3毫米的间隙。然后将胚胎从大培养皿中转移至蜡带上：将载玻片翻转，轻轻放于排好队的胚胎上，使蜡带与胚胎接触。

应将胚胎的后端朝下进行定位。转移后，胚胎将以背侧朝上的位置置于载玻片上，立即用玻璃解剖针将一滴XPBS滴加到胚胎上，以充满蜡画出的矩形区域，该玻璃解剖针是在拉针仪上制备而成，类似于注射针。从胚胎的后端开始，沿背侧中线进行切割。

现在用工具戳刺胚胎的前端并将其提起。从底部开始，将胚胎转移到胶带条右侧，保持其处于缓冲液中。继续解剖并转移胚胎，在载玻片上按顺序排列成行，使其与琼脂板上的每一行胚胎相对应。

使用解剖针轻轻将体壁的瓣膜压到载玻片上，避免拉伸或去除其表面的组织。解剖针仅应接触体壁背侧边缘的前角和后角。

由于运动轴突不会延伸到如此远的位置。背侧操作时，避免触碰载玻片上的针，否则在所有胚胎转移并固定到载玻片后，针可能会折断。通过切断脑区的四条肠道，并将整个肠道从胚胎上拉离，以去除每个胚胎的肠道。

将后肠移至载玻片上。完成所有解剖操作后，使用两支移液管，同时向蜡质矩形区域的一角加入室温的5%甲醛溶液，并从对角处吸除液体。总共使用约六毫升固定液，更换固定液三次。

将胚胎在固定液中孵育45分钟。必须注意避免弯月面接触胚胎，否则会破坏胚胎。使用移液器吸出大部分固定液。

使用两支移液管法用 PBS 洗涤 3 次。然后用 PBT 洗涤 3 次以透化胚胎。此步骤还可使胚胎对弯月面的敏感性降低。

最后一次洗涤后，轻轻倾斜玻片以去除PBT，并用Kim擦拭纸短暂接触石蜡圈闭区域的角落，以除去多余的溶液。立即使用预装的移液器加入200 µL封闭液，室温下封闭10至30分钟。随后用Kim擦拭纸吸去封闭液。

然后立即加入200微升用封闭液稀释的所需一抗。将切片置于湿盒中，在4摄氏度下孵育过夜。本实验中使用单克隆抗体1D four标记运动轴突。

第二天，将培养皿从4°C取出，在摇床上用PBT清洗胚胎三次，每次至少15分钟。所有洗涤步骤中，应确保有足够的PBT，以完全浸没摇动过程中的载玻片。胚胎洗涤完毕后，按之前方法进行封闭。

封闭后，立即加入200微升二抗和封闭液，在室温下孵育2小时。此处使用Alexa 488标记的山羊抗US二抗，并与罗丹明鬼笔环肽（Rodine Phin）联合使用以标记肌纤维。同样，在摇床上用PBT缓冲液洗涤三次，每次至少15分钟。

将切片转移至另一个托盘以去除残留的洗涤剂。随后用 PBS 洗涤两次，每次五分钟。从 PBS 托盘中取出切片，用化学擦拭纸吸去孔中大部分残留的 PBS，并立即加入 500 微升 70% 甘油。

由于甘油与胚胎的折射率相同，进行此步骤可使染色更明显。在室温下透明化胚胎两小时，或在4摄氏度下过夜。然后用无尘纸（kim wipe）去除甘油。几乎完全去除甘油会使胚胎变扁平，而去除较少甘油则会保留更明显的三维结构。

去除甘油后，盖上1号盖玻片。胚胎即可用于成像，解剖并染色的胚胎可通过免疫荧光显微镜观察。此处展示的是用运动轴突标记抗体1D四染色的解剖胚胎。

该图像在外观上与更常见的使用HRP免疫组织化学结合免疫荧光进行可视化的图像相似。可以获得质量更高的图像，使运动轴突分支的细节更清晰可见。利用与肌动蛋白结合的罗丹明标记鬼笔环肽进行共染色，可实现对肌肉的同步可视化。

这比使用HRP染色能够更清晰地展示肌肉的分层和组织结构。在此，1D四或运动轴突显示为绿色，Fein或肌肉显示为红色。我们刚刚演示了如何从突变品系的收集样本中解剖活体果蝇胚胎。在进行这些操作时，重要的是要从易于操作的品系开始，例如lio、armadillo、GFP、平衡品系，并且每次只处理少数几个品系。

随着您在解剖操作方面变得更加熟练和快速，每天最多可处理10个品系，这样您就可以在大约20天内筛选约200个突变品系。因此，一旦您熟练掌握所有操作步骤，这将是一个非常高效的流程。以上就是全部内容，感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。