在 Drosophila 胚胎运动神经元轴突投射模式的可视化

本实验的总体目标是分析黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）晚期胚胎中运动神经元的投射模式。该方法有助于回答神经发育领域中的关键科学问题，例如运动轴突导向及神经亚群的形成。该技术的主要优势在于能够对发育中胚胎的运动轴突进行精确可视化，从而实现对轴突路径寻找及其靶向连接缺陷的可靠分析。

设置卵收集板后一天，将板更换为含有少量新鲜制备酵母糊的新板。在新鲜板上放置三小时后，将果蝇转移至新的食物瓶中，并将卵板在25摄氏度下过夜培养。

早上，向培养板中加入 1.8 毫升 PBT 溶液，并用棉签轻轻搅动以使胚胎脱离。然后，使用 1 毫升移液器将胚胎和溶液转移至微量离心管中。

待胚胎沉至管底后，尽可能吸除溶液。随后用 1 毫升 PBT 洗涤胚胎两次，每次洗涤后更换溶液。为去除胚胎外壳，将最后一次洗涤液替换为 1 毫升 50% 漂白液，并在室温下轻轻摇动离心管 3 分钟。

为了去除漂白剂，用 PBT 将胚胎清洗三次。然后，将最后一次清洗液更换为 0.5 毫升 100% 庚烷和 0.5 毫升 4% 多聚甲醛。接着，在轻轻摇动的条件下，将胚胎孵育 15 分钟。

孵育结束后，移除下层溶液，并加入500微升100%甲醇。随后剧烈振荡管子30秒，以去除胚胎的卵黄膜。然后，移除上层溶液，再次加入500微升100%甲醇，并再振荡10秒。

振荡试管后，轻敲试管以帮助胚胎沉降，并尽可能吸除溶液。接着，用100%甲醇短暂冲洗胚胎一次。然后，立即用PBT冲洗胚胎三次。

现在，将胚胎重悬于1 mL新鲜的PBT中，并在37°C下孵育15分钟，以准备进行LacZ染色。在胚胎孵育的同时，准备1 mL的X-gal染色液。

将分装样品置于65摄氏度水浴中加热至浑浊。然后转移至37摄氏度金属浴中。胚胎在37摄氏度下继续温育15分钟后，吸除PBT溶液，加入1毫升染色液分装样品。

然后加入 20 µL X-gal 底物。将离心管在 37 °C 下轻轻振荡孵育约 2 至 4 小时，直至出现蓝色沉淀。随后，移除染色液，并用室温 PBT 将胚胎清洗三次。

清洗后，在解剖显微镜下使用针状探针或镊子手动分选胚胎。用1毫升移液器将目标染色胚胎收集至0.5毫米的微量离心管中。接着，用0.4毫升PBT洗涤所选胚胎。

然后，用 0.3 毫升封闭液替换 PBT，将胚胎在轻微振荡条件下孵育 15 分钟。15 分钟后，加入 75 微升一抗，继续孵育过夜。次日早晨，用 PBT 清洗胚胎约两小时，每隔约 30 分钟更换一次清洗液。

洗涤后，加入含有二抗的封闭液0.3毫升，在室温下轻轻振荡孵育过夜。次日早晨，用PBT洗涤胚胎约3小时，洗涤期间至少更换PBT五次。

洗涤后，将胚胎重悬于 0.3 毫升 dab 溶液中，并加入 2 微升 3% 过氧化氢。然后在室温下避光孵育，同时轻轻振荡，直至产生足够的沉淀。此过程通常需要 30 至 60 分钟。

然后，用 PBT 清洗胚胎四次，并将胚胎重悬于 0.2 毫升封片液中。接着，将胚胎置于 4 摄氏度避光条件下使其平衡。为了剖开胚胎，将其置于载玻片上进行操作。

首先将标本移入一滴甘油中，腹面朝上。接着，在解剖显微镜下，切去前端以及体长的1/4，并去除最末端区域（该区域无运动轴突）。然后，使用针状探针将标本从甘油中移出，背面向上，水平放置于视野中。

下一步需要使用一根细的钨针，该钨针已插入针状探针的中空区域，并在末端弯曲。用钨针在胚胎的后端做一个小切口，然后沿背侧中线继续切割。在解剖过程中，务必确保钨针的尖端不接触玻璃载片表面，因为针尖与玻璃接触时容易弯曲。

然后，将探针连同标本放回甘油滴中，并使其背面向上。在此位置，通过将每侧体壁向腹外侧展开，使其与体壁分离。两侧体壁应完全分开。

现在使用探针，小心地将体壁瓣移至载玻片上。在载玻片上，用钨针将内脏向侧方推除。为稳定钨针并防止其受损，在操作钨针时应保持空心针处于探入状态，并将钨针抵在载玻片表面以提供支撑。

现在，将样品置于新的载玻片上，用八微升封片液封片。加盖盖玻片，并用普通指甲油密封边缘。随后，使用微分干涉差（DIC）光学系统以高分辨率采集图像。

采用所述方法，对16期胚胎用Fas2抗体进行染色，以观察运动神经元及腹部半节A3和A4。正常情况下，至少有七个运动神经元会延伸其轴突并发生束化，形成ISNb神经分支。在此制备样本中，还可识别出许多周围的神经束。当节间神经束到达肌肉6和7处的选择点时，其中有两条轴突会选择性地去束化，并支配肌肉6和7。

随着神经束向背侧延伸，在其他选择点也会发生类似情况。然后，在最后一个选择点，两条轴突支配肌肉12。相比之下，在Sema-1a突变型胚胎中，相同的轴突在其选择点无法正常去束。

这一点并不意外，因为已知 Sema-1 aegean 产物在神经发育过程中有助于运动轴突与靶肌肉之间形成连接。因此，所描述的方法可用于分析突变体表型。观看本视频后，您应能够充分掌握如何筛选所需突变体胚胎、如何对运动神经元的轴突投射模式进行免疫染色，以及如何解剖固定后的胚胎以制备平铺样品。