基于二维加博尔滤波器的光散射显微技术

在本视频中，采用光散射显微技术定量分析细胞凋亡过程中的线粒体断裂现象。尽管光散射显微技术通常无需荧光标记，但本实验方案中将采集荧光图像以用于验证目的。在完成成像系统的设置后，细胞将用MIT tracker green进行标记，并用stor sporin处理以诱导细胞凋亡。

获取光学数据以检测细胞器在两小时内方向性的变化。线粒体断裂的起始可通过光学散射数据进行测量，该数据显示亚细胞颗粒方向性程度降低。随后通过将光学散射数据与含线粒体的荧光区域进行关联，对数据进行验证。

大家好，我是来自罗格斯大学生物医学工程系生物光学实验室的 Nada Bustani。我是生物光学实验室的 Rob Pak，我是来自生物实验室的 Deen。今天我们将向您展示一种无需使用荧光染料即可量化亚细胞形态动态变化的实验方法。

我们在实验室中使用该技术来研究细胞凋亡或程序性细胞死亡过程中亚细胞结构的动态变化。现在让我们开始。首先用70%乙醇对戴手套的手进行消毒。

然后将一管配制好的100纳摩尔浓度的Miot Tracker Green储备液和预热的BAEC细胞培养基放入超净台内，并关闭光源，对所有表面进行消毒。接着将接种在盖玻片上的六孔培养板置于超净台中。使用连接真空泵的巴斯德吸管。

从孔中移除细胞培养基，然后立即向每孔加入2毫升标记培养基以标记线粒体。盖好组织培养板，避免暴露于直射的室内光线下，并迅速将细胞放回培养箱中。

在细胞孵育的同时，于 37 摄氏度孵育 45 分钟。首先打开汞弧灯电源，启动光学装置。然后开启计算机、显微镜相机和激光器，将数字微镜装置（DMD）插入旋转扩散器中。

接下来，通过显微镜目镜观察光学激发是否已对准。视野应被激光均匀明亮地照亮。加载样品时，将一至两小滴浸油滴加在63倍油镜物镜上，此时物镜应处于最低位置。

然后在载物台上安装一个载玻片，其上带有以10微米为间隔的规则线条网格，称为格栅，并升高物镜，使镜油接触并聚焦。接着，调节聚光镜视场的六边形边缘，使其对焦，并调整至居中，实现科勒照明。

六边形边缘应在目镜中居中并清晰对焦。然后使用聚光镜视场光阑位置调节旋钮，将聚光镜视场光阑居中于视场内。启动 IP 实验室软件，并输入设置以操作相机。

确认相机已设置为帧转移模式。运行采集对焦命令以启动实时预览。然后设置索引前缀以及图像将要保存的文件位置。

接下来，启动 RS 成像。设置 Cool Snap 相机的工作参数，时钟模式应设为正常。

启动 DMD 软件。将暗场光圈放置在脚本菜单上，然后点击加载和重置。

手动运行脚本时，将显微镜视窗中的 optiv 栏设置为 LSM。这会将图像通过已对准光学系统的 DMD 进行传输，并将暗场图像投射到 Cascade five 12 相机的 CCD 上。

暗场图像应显示在IP实验室的实时预览中。如有必要，在实时预览中对图像进行聚焦。将曝光时间设置得足够长，以确保图像中的信号至少达到10,000计数。

然后在采集后使用“采集单张图像”命令拍摄视野快照。使用“另存为索引图像”命令将图像保存到磁盘。GTI 的图像用于测量视野的大小。

现在移动 GTI 样品，使其超出视野范围，仅显示背景。以足够的曝光时间拍摄该区域的背景图像，以获取至少 5,000 个计数。该图像将有助于对未滤波图像进行背景扣除。

现在，为了获取背景的加博尔滤波图像，请将加博尔滤波器组脚本加载到DMD控制软件中。运行整个脚本，以将滤波器缓存至DMD的板载内存中。一旦整个脚本完成缓存，可能需要几分钟时间。

使用 DMD 软件中的开始和停止标记，确保每次仅加载一组与一个类Gabor滤波器对应的滤波器。运行脚本以获取背景的滤波图像。实时图像预览应从暗场变为滤波后的图像。

对于该滤光片，从磁盘中在IP实验室中打开采集脚本。调整曝光时间，以确保至少采集到2000个计数。当DMD脚本运行时，取消IP实验室中的实时预览，并运行采集脚本。

这将自动获取索引并将滤波后的图像保存到磁盘。获取第一幅图像后，停止 DMD 中运行的脚本，并从脚本中删除已使用的命令。

然后替换下一组滤光片起始和结束位置的起始与终止标记。在 IP 实验室中重复采集过程，直至使用完全部滤光片组并获取和保存所有滤波后的图像。准备接种细胞：将电烙铁插入实验台电源并加热，同时将 L 15 培养基加热至 37 摄氏度。

准备一个工作台，铺上纸巾和无尘擦拭纸，以吸收任何溢出的培养基并保持区域清洁。通过撕开并捻搓无尘擦拭纸制备多个灯芯。这些灯芯将用于引导液体穿过细胞培养板。

接下来，使用金属样品托架制作细胞夹心结构。用移液器将一细条真空脂涂抹在加工好的金属板孔洞的上部边缘周围，涂抹范围约延伸至两侧凹槽末端的一半位置。轻轻地将一块洁净的1号盖玻片覆于真空脂上。

将培养皿翻转，在孔周围涂抹润滑脂。关闭室内灯光，戴上经乙醇消毒的NI试验检查手套。从培养箱中取出细胞。

从六孔板中取出将用于实验的盖玻片，小心地将盖玻片晾干。然后将盖玻片细胞面朝下压入涂有润滑脂的金属板上的观察孔中。

将细胞夹在培养板内，确保无气泡残留，并且石蜡已形成防水密封，以便加入培养基。现在将培养板翻转回来，每次移液 200 µL。

通过上层盖玻片与金属板之间的槽口，将预热的 L-15 培养基加入灌流小室，直至液体几乎到达另一侧的槽口。接着，在相对一侧的槽口处用吸水纸作为引 Wick，再用移液器向灌流小室内加入 200 µL 培养基，以洗涤细胞。随着吸水纸将旧培养基吸出，新鲜培养基会从一侧流向另一侧。

此步骤中需小心避免液体中产生任何气泡。每次冲洗使用新的灯芯，重复此过程两到三次。现在再次倒置培养板，从边缘支撑培养板，以使液体保留在细胞储液区中。

将烙铁浸入盛有 Veap 的烧杯中，快速熔化部分 Veap，使其附着在烙铁尖端。用烙铁尖小心地将熔化的 Veap 涂抹在底部盖玻片的边缘。持续重复浸入和涂抹操作，沿盖玻片的整个周边进行，将其密封固定在金属板上。

这样可形成良好的机械密封，防止在观察过程中盖玻片从培养板上脱落。用无尘纸揉成团擦拭盖玻片底面，清除任何残留物。

以单次滑动动作盖上盖玻片，确保盖玻片中心区域最洁净，该区域将用于观察。将六孔板放回培养箱。将接种有细胞的培养板送至光学实验室，并安装到物镜上。

与之前相同，找到一个状态良好的细胞区域，获取该视野的暗场图像。然后调整显微镜至微分干涉差（DIC）模式，并确保曝光时间适当。使用级联相机采集一幅DIC图像。

在此设置中，当显微镜仍处于微分干涉差（DIC）对准状态时，使用cool SNAP相机采集荧光图像。将显微镜的VAR设置为1倍，视口设置为100%双目，并将图像从目镜转向相机。在聚光镜上方放置一个蓝色LED以照亮视野。

然后在 RSS 图像中预览视野并调整细焦。如有必要，采集微分干涉相差（DIC）图像并保存至磁盘。注意此视野与级联相机所获得的视野有何不同。

这些图像需要在实验的分析阶段进行配准。接下来，将荧光滤光立方体移至工作位置，并通过显微镜快门短暂开启荧光激发光源以获取荧光图像，一旦图像采集完成，立即关闭光源。为尽量减少光漂白，应将荧光图像保存至磁盘。

为获得滤波图像，将显微镜重置至明场模式，并将光线导入 LSM 端口。与之前相同，运行完整的 Gabor 滤波器组脚本，以完成一个时间点的数据采集，此时细胞仍保留在载物台上，且不改变视野位置。采用毛细引流法，将常规 L-15 培养基更换为含有 1 µM STS 溶液的培养基。

在实验过程中，通过移液将培养基加入细胞培养板的沟槽中，以防止干燥，注意不要将培养板从载物台上取下或干扰观察视野。接下来，重复上述步骤，持续获取后续时间点的数据，直至实验结束。所收集的数据将包含大量经过筛选的图像，需进一步处理以提取亚细胞结构信息。

此处展示了两个示例实验。该图显示了一种海洋硅藻样品的连续图像，其定向特征清晰可见。

在暗场成像中，展示了标记为五等于0度至五等于160度的光学滤波图像，以及样品的未滤波图像。作为对比，对硅藻的一组九幅Gabor滤波图像进行了逐像素处理，以分析物体的取向。

在每个像素点，将最大信号与不同滤波器方向下的平均信号相除，得到一个各向异性比值。此处，接近1的各向异性比值以蓝色表示，出现在无显著偏好响应角度的区域；而以红色表示的较大比值则指示存在较高偏好角度响应的区域。

总GABOR滤波器响应的亮度和编码意义，以及在每个像素处产生最大信号的滤波器方向，对应于基础物体方向的垂直方向。亚结构颗粒的方向信息被编码在矢量图中，其中每条线段均与未滤波暗场图像中可见的基础局部物体方向高度一致。该矢量图显示了响应强度超过最大值10%的物体的取向。

该视野的暗场和光学滤光图像包含活体牛内皮细胞，在使用凋亡诱导剂staurisporin处理后，每隔20分钟采集一次滤光图像，持续三小时。此处，上方图显示了随时间变化的长宽比图谱，下方图显示了线粒体的荧光成像。颜色色调表示取向程度，与之前相同，这些时间曲线比较了经staurisporin处理的内皮细胞中颗粒长宽比取向程度的下降情况，单个轨迹代表单个细胞内的随时间变化曲线。

液滴的取向性局限于与荧光区域对应的细胞区域。现在，已实现对荧光的验证，结果具有可存档性。

因此，在接下来的实验中，可以通过省略荧光成像步骤，直接采用光散射方法进行线粒体测量。我们刚刚向您展示了如何利用基于伽博滤波器的光散射特征来监测凋亡过程中的线粒体断裂。在执行该操作时，重要的是要做好良好的细胞状态准备，并确保光学系统已正确对准和校准。

因此，让我们以合理的方式进行观察，并通过UI实验与CoLab协作。