共聚焦显微镜通过图像相关光谱法揭示细胞表面受体聚集现象

本图像相关光谱技术方案的总体目标是提供一种易于操作的方法，用于定量分析细胞表面发生的聚集事件。结合细胞表面受体的抗体可引起受体构象变化及聚集状态的改变。对这些动态过程的分析对于药物靶点的表征具有重要意义。

该技术的主要优势在于，它提供了一种可及的方法，利用易于获取的成像设备对细胞表面的聚集事件进行定量分析。首先，将10,000个A431表皮样癌细胞接种至八孔成像载玻片的每个孔中。次日，向细胞直接添加100纳克/毫升的EGF配体，以刺激EGF受体的聚集。

在固定细胞前，将细胞与配体在室温下孵育10分钟。接着，按照随附文本方案中的免疫细胞化学和共聚焦显微成像操作步骤进行操作，特别注意采集过程中使用的设置，并将获得的数据集载入Fiji。必须避免过度饱和。

最终图像的像素尺寸必须小于1平方微米。此外，还需在顶面或底面捕获一个平坦的表面区域，以及一个无细胞区域，用于后续样品归一化。首先，在第一幅图像中确定顶面或底面细胞表面膜的目标区域。

选择像素尺寸为 2 的 n 次方，范围为 256 × 256、128 × 128 或 64 × 64。然后，进入图像菜单，选择复制。接着，进入分析菜单，向下选择测量。

计算裁剪后的目标区域的平均强度。接着，从原始图像中选取一个相同大小的背景区域，并像之前一样进行复制。

计算背景裁剪区域的平均强度。在测量完目标区域和背景区域后，进入“处理”菜单，选择“图像计算器”。将目标区域设为图像1，背景图像设为图像2，并选择“减去”作为运算方式。

接下来，进入处理菜单。向下选择 FFT 并点击 FD Math。在 FFT 数学对话框中，按此处所示输入图像，并将操作设置为相关。

确保已开启逆变换。通过选择“process”，向下滚动到“math”，选择“divide”，并在对话框中输入总像素数，对得到的图像进行归一化。然后，再次除以归一化裁剪区域的平均强度的平方，进行二次归一化。

接下来，穿过点扩散函数绘制一条线。通过进入“分析”并选择“绘制轮廓”，绘制该线的轮廓图以计算峰值。将峰值转移至电子表格，以计算每束斑面积内的簇数量。

然后将每束光区域内的簇数设为峰值减一后的倒数。为了批量处理图像，建议建立一个 Fiji 宏。这有助于对多张共聚焦图像进行一致且快速的图像相关光谱分析。

为了建立图像相关光谱工作流程的宏，请设置程序以记录协议中的每个菜单命令。具体操作为：进入插件，向下选择宏，然后选择记录。接着返回主窗口，执行本视频前一章节中描述的协议流程。

完成后，返回宏窗口，选择“创建”以生成宏。接着，在宏编辑窗口中，务必选择语言为 LJ1 宏。若未选择，程序将无法运行。

最后，保存该宏。显微镜的光学传递函数确保了即使分子尺度的物体在 XY 平面上成像后也会呈现为 200 至 300 纳米大小的图像。通过按照本实验方案中所述的方法，以与细胞相同的方式对亚分辨率的荧光小球进行成像，可计算出显微镜点扩散函数的面积。

这些图像代表经EGF刺激和未刺激的贴壁A431表皮样癌细胞，细胞使用靶向细胞表面EGF受体的西妥昔单抗一抗进行标记。黄色框表示包含细胞膜的裁剪区域，像素尺寸为64乘以64。这些图像用于进行图像相关光谱分析。

在对自相关函数进行归一化处理后，可使用线条工具测量点扩散函数。通过绘制该线函数的轮廓以检测其峰值。采用这些方法发现，与未受刺激的细胞相比，EGF刺激导致每束光照射区域内检测到的EGFR簇数量减少了2.56倍。

一旦掌握，每张共聚焦图像的分析仅需几分钟。在进行此操作时，重要的是使用本方案中所述的设置，对每种实验条件收集多个重复样本。按照本流程操作后，可进一步扩展图像相关光谱技术，结合延时显微镜观察，研究活细胞中聚簇事件随时间发生的变化。

该技术问世后，为研究人员利用光漂白成像相关光谱技术探索高阶聚集状态，以及利用图像互相关光谱方法研究两种膜蛋白的共定位奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何计算目标细胞表面分子的聚集状态。