MALDI 样品制备：超薄层法
2007年4月29日
本视频演示了为通过基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI-MS）分析肽和蛋白质而制备超薄基质/分析物层的方法。
欢迎观看CHI实验室关于超薄层方法的教程，该方法特别适用于蛋白质的精确质量测定。由于质谱分析具有较高的敏感性，我们仅使用HPLC级试剂以及无粉乳胶或腈类手套来清洁样品板。依次用甲醇、水交替冲洗，最后再用甲醇冲洗一次。
每次冲洗之间，使用镜头纸轻轻擦去多余的溶剂。可根据需要重复这些洗涤步骤，直至获得干净的载玻片。清洁并干燥后，应立即使用该载玻片。
将20至30微升的薄层基质溶液涂抹于洁净的MALDI靶板上。此处我们使用P250移液器吸头均匀铺展溶液，同时避免划伤靶板表面。当薄层干燥时，如有残留水滴，可用无尘纸轻轻吸除。
然后用无尘纸以平稳的动作轻轻擦拭载样板，以形成均匀的薄层。最后，清洁载样板的边缘，避免污染质谱仪。在施加样品前，务必先检测薄层是否合格。
如果检测点干燥时间过长，且晶体分布不均匀，问题可能出在薄层本身或基质溶液上。此时应清洗板面，重新涂布薄层，并重新检测。在向薄层点样时，不应让样点完全蒸发至干燥。而应在结晶速度减慢并停止后，除去多余的溶剂。
使用真空抽滤器时，样品中存在盐类和去污剂等污染物以及分析物浓度过高可能会干扰结晶。进一步稀释样品可能有助于改善结晶。将基质辅助激光解吸电离质谱的校准点（Ants）点在靠近样品的位置，这将实现伪内标校准，即通过将靶板从样品点移动至校准点进行校准。
在样品采集过程中，向谱图中添加几束来自校准物（CAS）的激光，该方法相比仅使用外部校准，能够确保更高的质荷比准确性。必须彻底洗去可能干扰分析物电离的任何污染物，例如盐或洗涤剂。为此，可将冰冻的、含0.1%三氟乙酸的HPLC级水直接滴加到样品点上。
使用真空抽滤器（如图所示）移除洗涤液。该方法可获得膜蛋白和可溶性蛋白的优质谱图。
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概述
本视频演示了为通过基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI-MS）分析肽和蛋白质而制备超薄基质/分析物层的方法。该方法对于蛋白质的精确质量测定至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 质谱分析
- 蛋白质分析
- 分析化学
背景
- 质谱法是一种用于分析生物分子的高灵敏度技术。
- 样品靶板的制备对于获得准确结果至关重要。
- 建议使用高效液相色谱级试剂进行清洗。
- 正确的操作和清洗技术可提高分析质量。
研究目的
- 演示用于基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）的超薄层方法。
- 确保蛋白质质量测定的准确性。
- 提供样品制备最佳实践的教程。
使用的方法
- 使用高效液相色谱级试剂。
- 用甲醇和水清洗样品板。
- 用镜头纸擦去多余的溶剂。
- 清洗后的样品板应立即用于分析。
主要结果
- 演示了样本板的有效清洁方法。
- 强调了使用合适材料的重要性。
- 展示了超薄层的制备步骤。
- 提供了保持样本完整性的关键要点。
结论
- 超薄层方法对于准确的质谱分析至关重要。
- 正确的清洗和制备技术必不可少。
- 遵循最佳实践可显著改善分析结果。
常见问题
行业重要性概述
蛋白质的精确质量测定对于早期发现阶段的靶点验证和先导化合物识别至关重要。超薄层MALDI样品制备方法通过提高对杂质的耐受性和空间均匀性，提升了数据质量，支持对化合物进行可靠评估。该方法能够增强蛋白质表征的预测可信度，降低临床前模型选择中的机制性不确定性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够准确测定蛋白质的分子量，支持治疗假设的验证和功能靶点的确证。
- 操作价值：对盐类和去垢剂具有更高的耐受性，可减少易产生杂质样品中的假阴性结果。
- 预测价值：提高分辨率和空间均匀性，增强对蛋白质身份及修饰状态判断的可信度。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成高质量、可重复的光谱数据，对检测标准化和定量读数的一致性至关重要。
- 操作价值：采用简单且稳健的步骤，适用于高通量筛选环境。
- 可扩展性：可制备经过验证的样品板，用于下游工作流程，支持在不同项目间重复使用同一平台。
转化与临床前研究
- 转化连续性：支持膜蛋白和可溶性蛋白的分析，能够对与疾病相关的系统进行表征。
- 机制性风险降低：可对具有宽质量范围（高达 380 kDa）的蛋白质进行精确质量测定，有助于先导化合物的优化。
- 临床前模型一致性：适用于离子通道、转运蛋白和受体，支持在生理相关模型中进行靶点验证。
流程与工作流整合
超薄层方法适用于从早期靶点验证到先导化合物鉴定，再到临床前特征分析的整个发现过程，能够在每个阶段实现可靠的蛋白质分析。
- 发现生物学：通过提供精确的质量数据，支持蛋白质鉴定与表征中的假设验证。
- 筛选：提供可重复的定量结果，可在检测方法开发中实现可靠的化合物评估。
- 分析：生成具有空间一致性的高分辨率质谱数据，提高不同条件间数据的可比性。
- 转化研究：通过对多种样本类型进行一致的蛋白质质量分析，实现从发现研究到临床前研究的连续性衔接。
- 企业级复用：代表一种标准化且稳健的样品制备能力，适用于多种蛋白质类别和项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高蛋白质质量测定的预测置信度，降低靶点验证中机制性模糊的风险。
- 操作价值：实现标准化、可重复性，并对常见污染物（如盐类和去垢剂）具有耐受性。
- 战略价值：通过提升数据质量，优化“推进/终止”决策，降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于可靠的蛋白质表征数据进行风险校正后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备质谱样品处理和基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）原理方面的专业知识。
- 需要获取高效液相色谱级试剂、真空抽吸装置以及适用于MALDI的样品板。
- 要求采用标准化的清洗和干燥流程，以确保涂层均匀性。
- 需根据不同的分析物浓度和样品基质进行方法调整。
- 受限于样品板在清洗后必须立即使用，以防止再次污染。
生物制药常见问题
Chapters in this video
2:05
Step 5: test of the thin layer
2:50
Step 6: sample application
3:47
Step 7: calibrant application
1:52
Step 4: preparation of the matrix solution
0:58
Step 3: making the thin layer substrate
0:20
Step 1: cleaning of the sample plate
4:20
Step 8: washing step
0:46
Step 2: preparation of the thin layer substrate solution
5:05
Step 9: acquisition of mass spectra
