用于MALDI质谱成像的代谢谱分析样品制备

MALDI成像质谱技术是代谢组学领域的一项独特进展，使我们能够测量并可视化相对代谢物丰度及其分布情况，这些信息可反映生物体的生理和病理状态。MALDI成像的主要优势在于其能够在无需标记的情况下直接检测C2中的代谢物。在本实验演示中，由帕特里夏·卡西塔博士实验室的研究生Sami Sauma为您展示操作流程。

Yuki Chen 和 Kelly Veerasammy，来自我实验室的学生研究人员。收获组织后，立即将其放入装有液氮、已冷却的铝箔船中，并置于聚苯乙烯盒内。盖上聚苯乙烯盒的盖子，根据组织大小冷冻 2 至 10 分钟。

当组织充分冻结后，使用镊子取出包埋盒，并将包埋在铝箔中并置于干冰上的组织迅速转移至冷冻切片机。在切片前，注意不要向载玻片呼气。佩戴手套，并将万用表调至电阻模式，检测适量适用于基质辅助激光解吸电离（MALDI）分析的氧化铟锡涂层玻璃载玻片的导电性。

标记后，将切片置于干净的纸巾上，并放入已用70%乙醇清洁且温度设定为零下20摄氏度的冷冻切片机中。将组织样本放入冷冻切片机内，并根据组织类型调节冷冻切片机腔体和样本头的温度。待组织平衡30分钟后，使用冷冻组织包埋剂将组织固定于样品头（chuck）上。

将干净的刀片安装到切片机载物台上并固定，调整载物台位置和样本角度，以达到所需的切削角度。连续切片直至暴露出目标区域。当到达目标区域后，切取10至12微米厚的切片，使用预冷的毛笔迅速而小心地将每张切片收集到已标记的载玻片一侧。

将手指置于载玻片下方以温热组织切片，确保切片牢固地贴附在载玻片上。切片将在5到10秒内变得透明，并在约30至60秒后变为不透明。当所有切片收集完毕后，将载玻片放入载玻片架中，并置于干冰上运送至干燥器。

或者，可将载玻片放入真空盒中携带。将载玻片置于含有干燥剂的干燥器中，抽真空干燥45至60分钟。干燥后，若不立即使用，请将载玻片放入载玻片转运盒中，并用氮气充满转运盒。

用Parafilm密封载片架，并将载片架放入自封袋中。然后将第一个自封袋放入第二个带有标签且内含干燥剂的自封袋中，于–80摄氏度条件下保存，最长可保存六个月。脱水后，使用粗头银色记号笔在组织切片区域以外的载片空白处标记X形记号，再用细头黑色记号笔在每个银色X形记号上叠加标记一个黑色X。将一张载片装入MALDI质谱金属靶板中，并在载片上覆盖塑料盖板。

在塑料覆盖物上标出样品位置，将载玻片和MALDI靶板放置在平板扫描仪的表面。然后预览载玻片并选择所需区域。以16位灰度、2,400 dpi进行扫描，并将图像保存以供后续使用。

为载玻片点样基质时，打开自动基质喷涂仪，确保阀门处于加载位置，并启动喷涂软件。检查排风扇是否正常工作，并在通信选项卡下确认系统通信正常。以约 500 psi 的背压，将溶剂泵的流速设为 100 µL/min 启动。

启动氮气罐，将其压力设为每平方英寸30磅，以开始向基质喷雾器供应压缩空气。调节喷雾器前端的压力调节器至每平方英寸10磅，并根据需要设置喷雾器喷嘴温度。在阀门处于加载位置时，使用注射器用7毫升70%甲醇冲洗环路，然后用6毫升基质溶液填充环路。

将一片空白的载玻片放入支架和喷雾器中，并用胶带固定两端以防止移动，检查流速和温度是否稳定。按下启动按钮，设置喷嘴温度并调节泵的流速，以匹配所选方法。将阀门从“加载”切换至“喷雾”，然后单击继续。

让系统运行至完成。当沉积结束后，将阀门从喷雾切换至加载位置，然后点击继续。在显微镜下观察基质编码的模式。

若观察到一层均匀的细密基质结晶，则按照上述方法将基质沉积到相应的样品载玻片上。当所有载玻片处理完毕后，应根据制造商的说明清洁系统，以防止喷雾器喷嘴堵塞。此处展示的是从每 100 道尔顿间隔中选取的质荷比信号所生成的 MALDI 质谱成像数据分析输出图像，清晰地体现了该技术在从小分子代谢物到高分子量脂质的谱图鉴定中的应用价值。

每张图谱展示了特定代谢物在出生后第1天、第21天和第60天采集的三种组织中所对应的离子热图，包含其空间分布和光谱信息。MALDI质谱成像（MSI）技术的一个优势在于能够根据质荷比识别出的特定物种，判断其与发育阶段或特定解剖结构的相关特异性。在本分析中，某些代谢物被发现富集于出生后第1天的新生个体或出生后第60天的成年个体中，而另一些代谢物则在所检测的各个年龄段中呈均匀分布。

其他分子物种被发现特异性富集于灰质、白质或脑脊液及脑室中。研究还分析了代表性代谢物的空间分布，包括次黄嘌呤、谷氨酸、N-乙酰天冬氨酸、花生四烯酸以及多种脂类。为保持代谢状态的真实性，适当的样本解剖、储存以及冷冻切片对于防止人为代谢变化至关重要。

完成 MALDI 实验后，您可能需要验证所发现代谢物的身份。这可以通过微萃取结合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）来实现。MALDI 质谱成像技术能够以空间分辨的方式促进基于代谢组学的研究，使研究人员有机会在定量且可视化的媒介中获取代谢数据。近年来，饮食对神经退行性疾病的影响，以及肠道微生物组与大脑之间的关系，受到了广泛关注。

因此，从神经发育到神经退行性病变，代谢研究在神经科学中具有极其重要的意义。肠道-大脑相互作用是一个关键事实。在这一背景下，MALDI成像技术平台的理念能够提供卓越的技术，用于可视化特定干预对大脑可能产生的影响。