实验性转移检测

以下实验的总体目标是通过尾静脉注射来检测人类癌细胞的转移能力。将细胞在免疫缺陷小鼠体内进行注射前准备，随后将细胞注射入免疫缺陷小鼠体内，经过一至两个月后，小鼠将形成肺转移灶。

处死小鼠后进行解剖，定量并培养肺转移灶。此类检测的结果可表明特定类型癌细胞的转移程度。大家好，我是来自罗切斯特大学生物医学遗传学系LE博士实验室的Sonali Mohanty。

今天我们将向您展示一种进行实验性转移检测的方法。我们在实验室中使用该方法来研究癌症转移。现在让我们开始吧。

取生长至约70%汇合度的细胞，吸去培养板中的培养基，用一倍体积的PBS轻柔洗涤一次。随后，加入2毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，轻轻摇动培养板以促进细胞脱落。

在显微镜下观察细胞脱落情况。加入含有胎牛血清（FBS）的足量培养基以终止胰酶的消化作用，然后转移至50毫升离心管中。

使用血细胞计数板对细胞进行计数。确定浓度后，在不扰动细胞沉淀的前提下，以约200 ×g离心3分钟。小心吸除培养基，用适量的Hank's平衡缓冲液（HBSS）重悬细胞，使其最终浓度达到约5 × 10⁶ 个细胞/毫升。

接下来，使用 Falcon 70 微米细胞滤网进行过滤。为去除较大的细胞聚集体，将移液器吸头直接置于放置在 5 毫升培养管上的滤网上，迅速将悬液通过滤网排入管中。

使用台盼蓝再次计数细胞以确定细胞活力。注射前细胞活力应高于90%。然后将细胞稀释至终浓度为每毫升2.5×10⁶个细胞。

保持在冰上。轻轻抓住一只免疫缺陷小鼠的尾巴，将其拉入小鼠固定器中，使小鼠背部紧贴狭缝，尾巴从小后方的小开口伸出。缓慢沿狭缝将环向内滑动。

当套环卡住小鼠的嘴部后，将其固定到位。小鼠不应能自由活动，但应保持正常的呼吸频率。找到尾部的主要静脉。

小鼠尾巴中存在四条主要的血管。动脉位于尾巴的背侧和腹侧，静脉则位于两侧。

将至少200微升的制备好的细胞吸入一个1毫升的注射器中。安装一个30号半针头，并排出所有气泡。注射器中的最终体积应为200微升。

准备向尾部远端注射。如果首次尝试失败，可使用尾部更近端的区域进行第二次尝试。用70%乙醇擦拭注射部位后，将尾巴拉直。

用拇指握住针尖，以食指固定注射点。将针头插入静脉并注入细胞。注射过程中，确保针头和注射器与静脉保持平行。

否则，针头会刺穿血管壁，导致细胞被注入尾部周围组织。若操作成功，应撤出针头。血液应从注射部位灌注流出。

按压干净的棉球以方便使用牙线，并从下向上触诊尾部，促使任何残留样本进入循环。将小鼠从固定器中释放并放回笼中。在实验记录本中记录注射尝试次数以及注射的细胞数量。

在注射后测定细胞的活力。此步骤与之前一样，用于确认细胞在整个注射过程中保持存活。在注射实验结束时，细胞活力会有所下降，但应保持在80%以上。作为可选步骤，可将剩余细胞离心，沉淀用PBS洗涤一次。

然后将沉淀物在 minus 80 degrees Celsius 下冷冻，以用于后续分析，如蛋白质印迹。为验证基因在敲低后的表达情况，在 1 至 2 个月后解剖小鼠以确定转移灶的位置。首先将已处死的小鼠置于解剖台上开始操作。

用乙醇充分喷洒小鼠。剪开肋骨以暴露肺和心脏，然后小心地将其取出并置于 PBS 中。

肺是转移的主要部位，因为它含有细胞进入循环后所遇到的第一个毛细血管床。细胞进入循环后，取出心脏，用 PBS 冲洗肺组织，然后在解剖显微镜下观察肺的每个叶。计数肺两侧可检测到的转移灶数量，再将四个肺叶的肺转移灶数量相加，以确定肺转移灶的总数。

接下来，使用剪刀切除并分离单个肺转移灶。将每个转移灶转移至70微米细胞筛中，并用无菌针帽末端将其切碎。用数毫升培养基冲洗细胞筛，收集滤过筛网的细胞。

在培养皿中，每个培养皿含有一个转移灶的细胞。将细胞在37摄氏度下孵育，至少四天内不要扰动。最初，癌细胞和成纤维细胞都会在培养板上生长，但随着时间推移，成纤维细胞将逐渐死亡并被癌细胞取代。

如果癌细胞携带任何耐药基因，则使用相应的抗生素筛选细胞。三天后，用 PBS 洗去培养皿中的血液或组织碎片及残留物，并加入新鲜培养基。通过针对人特异性蛋白的抗体进行免疫染色，评估所获得细胞的纯度；此处即使未进行药物筛选，也使用抗人脑膜抗体。人源细胞比例应超过 99%。

现在可将新获得的细胞再次注射到免疫缺陷小鼠体内，以在本实验结束时检测其转移能力。高转移性癌细胞系通常会产生大量肺转移灶，而低转移性癌细胞系则仅形成极少的肺转移灶。这些图像显示了注射人黑色素瘤细胞系两个月后的肺转移情况。

375 个细胞。使用该方法获得的细胞在测试时通常比亲本细胞系产生更多的转移。再次通过该实验，我们刚刚向您展示了进行实验性转移实验的操作步骤。

进行此操作时，必须牢记确保将细胞注入尾静脉，而非尾部皮肤或尾部组织。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。