一种用于鉴定黑色素瘤转移新介质的可靠发现平台

本方案描述了一系列可在连续工作流程中使用的技术，用于评估黑色素瘤转移及其他实体恶性肿瘤转移候选调控因子的体内效应。我们系统化工作流程的主要优势在于，由于采用了稳健且标准化的体内模型和技术，数据的可重复性显著提高。该流程通过在体内环境中验证从组学数据或体外实验推导出的候选分子，为靶点发现和治疗开发提供了可行路径。

通过使用本方案提供的材料并按照详细描述练习各步骤，可缩短掌握这些技术所需的学习曲线。 Orlando Aristizabal（Preclinical Imaging Core 的科研人员）和 Ran Moubarak（我实验室的讲师）将协助演示该操作流程。进行皮内注射时，需在生物安全柜内对8至10周龄的小鼠实施麻醉并剃毛，同时保持无菌条件。

然后，沿针头穿刺方向反向牵拉并固定皮肤，使用一支长度为6毫米、31号规格的胰岛素注射器针头，针尖斜面向上，以较小的锐角轻柔刺入皮肤。缓慢注入30 µL肿瘤细胞悬液，直至观察到圆形隆起的皮丘。密切监测肿瘤生长进展、体重变化及整体健康状况。

在这些监测过程中，使用卡尺进行测量，并利用肿瘤的长度和宽度计算其体积。对于心脏内注射，将麻醉的小鼠转移至超声设备的加热平台上，然后使用低致敏性胶带将小鼠固定在鼻罩上。

使用直刃剃刀或手术刀片，以30度角倾斜剃除胸部毛发，并用10%聚维酮碘清洁操作区域周围的皮肤。然后，将超声探头置于小鼠左侧胸部中央，获取水平切面，以获得左心室的横截面图像。将探头长轴朝上，固定探头于50度角，加热平台固定于20度角，随后将探头及支撑架锁定在该位置。

在生物安全柜内操作时，使用带有30号一英寸针头的1毫升结核菌素注射器吸取细胞悬液。去除注射器中可能存在的气泡。将注射器固定在立体定位注射仪上。

然后在超声引导下，将针头穿过胸壁进入心脏的左心室，缓慢注射100至250微升的肿瘤细胞悬液。对于分期存活手术，将麻醉后的小鼠置于保温垫上，用10%聚维酮碘溶液清洁手术区域周围的皮肤。穿戴无菌个人防护装备和手套后，在动物体表覆盖无菌手术单。

接下来，使用虹膜剪或手术刀切开皮肤，切缘距离肿瘤边缘保持5至7毫米。对于皮内肿瘤，应将肿瘤及其周围皮肤一并切除。对于皮下肿瘤，则需在皮肤下分离并切除肿瘤。

肿瘤切除后，使用9毫米的缝合器关闭切口。进行活体成像时，用1毫升胰岛素注射器和28号针头通过腹腔注射的方式向小鼠注射D-荧光素底物，随后麻醉小鼠并将其放入生物发光成像仪内的鼻罩中。按下“初始化”按钮启动仪器，并将曝光时间设置为自动。

为获取用于背景扣除的空白图像，请点击采集，待采集序列完成后保存图像。进行数据分析时，在同一活体成像软件中，导航至图像保存的文件夹，并打开同一次实验中所有小鼠的图像。将单位设置为辐照度，并确保不要勾选“个体”复选框，否则将无法对不同组间的信号进行归一化处理。

接下来，使用感兴趣区域（ROI）绘制工具，为脑区绘制圆形感兴趣区域，为身体绘制矩形感兴趣区域；在划定脑区ROI时应排除耳朵和鼻子，因为这些部位容易产生非特异性发光信号。为尽量减少偏差，应在未叠加发光信号的小鼠照片上绘制ROI，然后选择“测量ROI”以定量信号，并将数据导出至电子表格中。通过绘制感兴趣身体区域的总发光通量，分析各组之间的差异。

使用软件对NuMA染色后，绘制一个ROI以包含器官组织内所有NuMA染色的细胞，但排除其他器官实质和空白区域。调整设置，根据每种器官的适当阳性和阴性对照，对NuMA阳性细胞和NuMA阴性细胞进行分类。使用已建立的软件算法，量化每个样本中NuMA阳性细胞的总数及所占百分比。

生物发光、明场、离体荧光以及苏木精和伊红染色图像展示了分析候选基因对黑色素瘤转移影响的多角度方法。岩藻糖基转移酶的沉默抑制了黑色素瘤细胞的转移扩散。本图显示了感染对照Linda病毒以及表达转移抑制因子的Linda病毒的黑色素瘤细胞在肺组织切片中的NuMA染色结果。

转移性黑色素瘤细胞标记为绿色，器官区域由绿色虚线勾勒。在进行皮内注射时保持皮肤适当的张力，准备注射器时避免空气栓塞，获取足够且不影响动物运动能力或导致伤口并发症的切除边缘，这些措施有助于提高实验成功率和可重复性。进一步采用多重成像技术检测免疫细胞浸润，利用单细胞RNA测序进行基因表达分析，以及应用空间转录组学技术，均可为研究肿瘤内异质性提供互补的研究途径。

本方案中所述技术的结合帮助我们鉴定了黑色素瘤脑转移中的新型调控因子，例如黑色素瘤分泌的淀粉样β蛋白在抑制神经炎症和促进脑转移中的作用。