荧光显微镜下观察细胞电融合

电融合技术涉及对紧密接触的细胞施加短暂的高电压电脉冲。在本视频中，我们通过改良的贴壁法展示了体外细胞电融合的操作过程。实验以小鼠黑色素瘤细胞BF one为材料进行。

进行实验时，请按照以下步骤操作。将细胞分别接种于两个独立的培养瓶中，培养至80%融合度。随后，分别向其中加入2.1 µL的每种储备溶液。

在离心管中，将10毫摩尔的C-M-F-D-A或CMRA分别加入3毫升克雷布斯-赫斯缓冲液中。用克雷布斯-赫斯缓冲液冲洗细胞两次，然后将负载溶液加入培养瓶中。负载溶液分别含有约7微摩尔的C-M-F-D-A或CMRA。

在受控环境中孵育细胞30分钟。在第一次孵育期间，染料可自由穿过细胞膜进入细胞质，并在其中转化为对细胞膜具有通透性的反应产物。第一次孵育结束后，洗涤细胞，然后用培养基再次孵育细胞2小时。

使用配备有冷却CCD相机的荧光显微镜，并通过采集软件进行观察。对于负载CMRA的细胞，将激发波长设置为548纳米，并选择适当的带通滤光片以获取红色荧光图像；对于负载C-M-F-D-A的细胞，将激发波长设置为492纳米，并选择适合的带通滤光片以获取绿色荧光图像。分别对两个培养瓶中的细胞进行计数，然后将红色和绿色荧光标记的细胞按1:1的比例混合，并调整细胞浓度至每毫升500万个细胞。

在每个孔的中央加入20微升细胞悬液。将细胞置于24孔多孔板中，在控制气氛下孵育20分钟，使细胞轻微贴附于孔表面形成单层，并建立细胞间的相互接触。随后将含细胞的多孔板放置于显微镜载物台上。

将电极置于孔板底部，并将其连接至脉冲发生器。为实现最佳电融合效果并维持细胞活性，应采用合适的电脉冲参数。这些参数取决于细胞系，需通过预实验确定。移除培养基，并用1毫升ISO omu磷酸钾缓冲液洗涤细胞，随后加入350微升低渗Miller磷酸钾缓冲液以诱导细胞膨胀。

将细胞置于高渗缓冲液中两分钟后施加电脉冲。应在细胞接近其最大体积时施加电脉冲，即在细胞启动调节性体积减小之前。

我们实验中的减少。施加一串由八个持续时间为100微秒的矩形脉冲组成的脉冲序列，频率为1赫兹。脉冲输送后。

10分钟后，再静置细胞10分钟。通过相差显微镜和荧光显微镜测定扩散效率。在五个随机选择的视野中，各采集三张图像，分别为相差、红色荧光和绿色荧光图像。

在每张图像中，将在 ImageJ 软件中对每个图像三联体创建三个通道图像，以提高图像的视觉质量；预处理步骤可应用于原始图像，包括背景减除和使用默认参数集进行对比度增强。最后，使用 RGB 转灰度 ImageJ 插件合成三通道图像。在此类图像中，可同时观察到静息状态的细胞质和细胞膜。

因此，在三通道图像中，可轻松识别并计数三种类型的细胞：红色荧光细胞、绿色荧光细胞以及双荧光细胞。通过将每幅图像中双荧光细胞的数量除以该图像中所有细胞的总数，计算双荧光细胞的百分比。融合效率则定义为双荧光细胞百分比乘以2。

当相同颜色的视图细胞重叠时，有一半的视图细胞无法被检测到。