相关联的光学与电子显微镜技术（CLEM）作为可视化显微注射分子及其真核细胞亚细胞靶标的工具

以下实验的总体目标是将荧光标记的小分子或蛋白质导入培养的哺乳动物细胞的细胞质中，并在微米至多纳米分辨率下观察所诱导的形态学变化。该目标首先通过在带网格的玻璃盖玻片上培养哺乳动物细胞，然后使用显微注射技术将荧光标记的目标小分子或蛋白质注入细胞内来实现。随后，用甲醛固定细胞，并利用荧光显微镜进行观察和成像。

然后用戊二醛固定细胞，进行切片、染色，并使用电子显微镜成像。最后，将明场荧光显微镜和电子显微镜下获取的图像进行合并与对齐。最终，通过这些图像的关联分析，研究人员能够以高分辨率观察由目标小分子或蛋白质诱导的结构变化。

大家好，我是德克萨斯大学西南医学中心微生物学系Neil Alto博士实验室的Evan Reddick博士。今天我将向大家介绍M Clem技术，即显微注射关联光镜与电镜技术。该方法相较于单独使用的显微注射或显微镜技术的主要优势在于，这些技术在此过程中协同进行，并借助了带网格的玻璃盖玻片。

正是这种带网格的盖玻片使得研究人员能够在实验方案的不同阶段返回到同一个细胞。此外，该技术使研究者能够观察由多种可注射的小分子或目的蛋白所诱导的亚细胞结构变化，并且可在微米至多纳米分辨率下进行观察。为进行显微注射，需将正常大鼠肾细胞或永生化宫颈癌细胞等培养细胞接种于固定在活细胞培养皿上的光刻蚀玻璃网格盖玻片上，于37°C和5%CO2条件下培养细胞。

根据所使用的实验时间线，调整细胞的汇合度。完全汇合的培养板将使电镜下难以识别显微注射的细胞。因此，接种细胞时应使其在短期实验当天达到约50%的汇合度，而对于较长时间的实验，则应使其汇合度约为25%。

在进行较长时间实验的当天，将荧光标记的蛋白质、DNA 或小分子用适当的缓冲液配制，终体积为 50 微升。根据所选荧光染料的类型，加入示踪染料（如德克萨斯红或瀑布蓝）。加入浓度为 0.5 至 1 毫克/毫升。

使用0.22微米的离心滤器过滤溶液。按照制造商的指南拉制显微注射针后，小心地将数微升溶液用移液器加入到针的后端。将注射针装入连接倒置显微镜的商用显微注射装置的显微操作臂中。

将培养细胞的培养皿放入倒置显微镜的载物台中。找到在光刻网格内生长的细胞，并记录该网格的字母数字标识符。此标识符将在后续所有步骤中使用。

选择用于显微注射的细胞时，应挑选紧贴盖玻片中央区域附着的细胞，避免使用靠近边缘的细胞。这一点非常重要，因为这能确保将目标细胞高效地转移至后续透射电镜所用的环氧树脂中心样品台。手动缓慢降低注射臂至盖玻片上方，并使用显微操作器将注射针缓慢下移，直至针尖轻轻接触细胞表面。在选定的网格区域内，每隔一个细胞进行一次显微注射；对于约50%融合度培养的细胞，预期每600平方微米的网格内约有80个细胞，可获得约30至40个实验组和对照组细胞。

注射后，将培养皿放回培养箱中，在所需时间内孵育以进行荧光显微镜观察。弃去培养基，用PBS中的甲醛在室温下固定细胞10分钟。用1×PBS替换固定液。

然后在低倍和高倍镜下拍摄所选网格区域的5到10张明场图像，以记录细胞的排列情况。为识别显微注射的细胞，需在惰性注射染料的激发波长和发射波长下拍摄荧光图像。使用共聚焦显微镜，在先前已成像的同一网格区域内，对显微注射的细胞在高倍镜下采集Z轴层扫图像。

为了将荧光图像与通过电子显微镜识别的亚细胞结构进行关联，需要高倍放大。共聚焦成像后，使用盖玻片去除液将盖玻片从培养皿上分离，并将其细胞面朝上放入含有1倍磷酸盐缓冲液（XPBS）的新鲜培养皿中。随后进行电子显微镜样品处理。

按照标准的透射电镜（EM）操作规程进行。为了固定染色并脱水样本，需制备环氧树脂，并将盖玻片的细胞面朝下放置在充满环氧树脂的模具上。于60摄氏度下使树脂聚合24小时。

为了从环氧树脂中移除盖玻片，将其迅速浸入液氮中。温度从60摄氏度骤降至零下196摄氏度，产生热冲击。

将盖玻片从树脂管上剥离。等待5到10分钟，然后取出树脂管，此时盖玻片已完全脱离。在解剖显微镜下检查树脂表面，以定位目标网格区域。

使用无菌剃刀刀片或手术刀修整环氧树脂包埋块，使仅目标区域位于包埋块顶端，随后用超薄切片机对修整后的包埋块进行连续切片。采用醋酸铀和柠檬酸铅按照标准方案对切片进行染色对比。结合先前获取的高分辨率荧光图像，以细胞的相对位置为参考，在透射电子显微镜下重新定位目标细胞。

在透射电镜照片中识别与荧光信号相对应的兴趣区域。利用异染色质位置和核膜等解剖标志，确定荧光Zack图像与透射电镜切片的对应关系。使用Image J或Adobe Photoshop等成像软件，将荧光图像的不透明度降低至50%，然后将其叠加到相应的透射电镜图像上。

通过调整显示的标尺来对齐图像。以下是显微注射及关联的光学显微镜与电子显微镜分析的结果。该图像显示了生长在激光蚀刻玻璃网格盖玻片上的NRK细胞的明场显微照片。

注意用于标识含有注射细胞网格的背景字母 b 和 m。箭头指示了通过电子显微镜识别并成像的两个细胞。图中显示的是用于识别显微注射细胞的惰性示踪染料 cascade blue 的荧光图像。

这是胺标记小分子的明场与荧光信号叠加图像。该图示展示了注射细胞的明场荧光显微镜与电子显微镜图像的相关性。箭头指示了本图中高倍放大下成像的荧光点状结构。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过显微注射技术注射目标蛋白，并利用显微注射Clem或相关联的光学与电子显微镜技术，追踪该蛋白所诱导的亚细胞形态学变化。