从软性肌肉骨骼组织中分离干细胞

本实验的总体目标是从骨骼肌等肌肉骨骼系统的软组织中分离成体干细胞。首先取软组织活检样本，进行清创并精细剪碎。实验的第二步是通过酶消化法处理组织。

该操作流程的第三步是通过反复预贴壁步骤分离干细胞。流程的最后一步是鉴定已分离的干细胞。最终，可通过免疫荧光、显微镜检查和/或流式细胞术获得结果，以展示细胞的形态学特征和细胞行为。

大家好，我是来自匹兹堡大学骨科手术系分子病理学实验室的 y Lee。今天我将向您展示如何从骨骼系统的软组织（如骨骼肌）中分离成体干细胞。大家好，我是 Johnny Ward 博士。

我是匹兹堡大学医学院骨科系的一名教授。我一直在与Young Lee博士密切合作，开展从骨骼肌和标准等其他组织中分离不同类型干细胞的相关技术。我们在实验室中应用这些技术，主要用于干细胞的分离，以支持转化医学应用方面的基础研究。

因此，让我们开始研究。可用于分离干细胞的组织包括从野生型小鼠后肢胫骨或比目鱼肌获取的肌腱和骨骼肌。去除皮肤和骨骼残余物后，将组织置于含有添加5% FBS的冷HBSS的培养皿中。

接下来，将组织分别置于含有冷HBSS的胶原蛋白包被培养皿中。我们将使用骨骼肌组织来演示组织解离和消化的基本操作步骤。使用显微剪刀和/或手术刀片将骨骼肌组织切碎成粗浆状，以进行后续的酶消化处理。

首先将MIT组织匀浆分别转移至15毫升离心管中，在4°C条件下以约3,500 RPM离心5分钟。通过在HBSS中重悬去除SANE洗涤液，并重复离心步骤。去除上清液后，加入10毫升预热的0.2%胶原酶进行消化。

11型在37摄氏度孵育60分钟，每10分钟手动摇动试管一次；60分钟孵育结束后，离心并将沉淀重悬于10毫升DYS溶液中。在37摄氏度孵育45分钟，每10分钟手动摇动一次；45分钟孵育结束后，离心并将沉淀重悬于10毫升含0.2%吐温-20的HBSS溶液中。

通常在37摄氏度孵育15至20分钟，每10分钟颠倒试管一次，孵育即完成。当有足够数量的单个细胞从组织中释放出来时（如图所示），离心收集所得细胞，并将细胞沉淀重悬于5毫升增殖培养基（PM）中。通过一系列针头吹打使细胞悬浮液充分解离：先用18号针头吹打两次，再用23号针头吹打一次，最后用27号针头吹打一次。

最后，将细胞提取物通过70微米细胞筛，以开始prepl技术。将刚刚制备的细胞提取物离心，并将沉淀重悬于增殖培养基中。取5毫升细胞混合物接种至胶原包被的T25培养瓶中，标记为PP1，在37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育2小时。

两小时后，将非贴壁细胞转移至一个新的胶原蛋白包被的 T25 培养瓶中，并标记为 PP2。向之前标记为 PP1 的 T25 培养瓶中加入 5 mL PM 培养基。

将两个培养瓶放回培养箱中培养24小时。24小时后，将PP二中的非贴壁细胞转移至一个新的经胶原蛋白ENC包被的T25培养瓶中，并标记为PP三。向标记为PP二的培养瓶中加入5 mL增殖培养基。

将培养瓶放回培养箱。每24小时重复一次该操作，直至第六代群体。干细胞群体由此建立。

分离得到的PP六细胞数量很少，需在富含FBS的增殖培养基中维持培养，培养基需每日更换。尽管如此，在随后一到两周的培养过程中，PP六细胞培养物中的大部分细胞将会死亡。

经过额外一到两周的扩增后，通常会形成大量健康的PP六代细胞群体。同时维持所有其他悬浮细胞群，使其增殖，并定期使用倒置显微镜进行观察。早期贴壁的细胞主要为纤维化细胞，会附着在PP一代和PP二代培养瓶上。

在48至96小时的较长时间后，贴附于胶原蛋白包被的培养瓶上的细胞。PP三和PP四主要为成肌细胞。而肌肉卫星细胞通常多见于PP五，后期的预分离细胞（96小时或更晚的PP六）被视为成体干细胞，形态较小、呈圆形且透明。

在分离初期，可通过免疫组织化学方法进一步表征这些细胞，检测其是否表达干细胞标志物，例如干细胞抗原1（stem cell antigen one）和CDC 34。我们刚刚向您展示了如何从小鼠的第二块组织中分离干细胞。进行该操作时，重要的是要记住在整个实验过程中始终保持类固醇的存在。

一旦分离出干细胞，务必以低密度培养这些细胞，以维持其干细胞特性。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验顺利，也祝您在实验中成功应用该技术。

谢谢。