使用磨薄颅骨制备法对小鼠视觉皮层进行长期成像

树突棘是神经元树突上的膜突起，负责接收突触输入。树突棘的伸长、缩小或消失会随着神经网络功能的变化而发生，而神经网络功能的变化源于特定模式的神经活动。这一现象被称为皮层可塑性，用于观察树突棘的形态学变化。

在活体动物中，将成像板固定在小鼠颅骨上。通过手术将颅骨某区域磨薄，随后在低倍和高倍镜下采集图像。之后在不同的时间点对相同区域重新进行成像。

实验结果表明，利用薄颅骨制备方法可在多个时间点清晰地观察到树突棘的形态。并且树突棘形态具有高度可塑性，表现出结构上的变化，以及树突棘的出现与消失。大家好，我是来自罗切斯特大学神经生物学与解剖学系Anaya Maka实验室的Emily Kelly。

今天，我们将向您展示一种在称为开颅准备的操作后对小鼠视觉皮层进行慢性成像的实验方法。我们实验室采用该方法研究树突棘的周转情况。现在，让我们开始吧。

开始操作前，对无菌手术器械进行灭菌处理。随后使用70%乙醇对操作区域进行消毒，并用无菌敷料覆盖操作台面。通过脚趾夹捏测试来监测接受芬太尼混合麻醉剂麻醉的小鼠的麻醉深度，此处所示小鼠为A-G-F-P-M转基因小鼠，其表达GFP。

在第五层，顶盖细胞的树突过程投射到浅层。为维持37.5摄氏度的体温，将动物置于加热垫上，并使用直肠温度计进行监测。然后使用剪刀涂抹眼用软膏以防止眼睛干涩。

将小鼠头部耳后至眼睛区域的毛发去除。然后用70%乙醇擦拭动物头部表面，随后使用碘伏擦拭液和碘伏溶液进行消毒。根据需要成像的大脑半球，在耳后沿中线右侧或左侧做一个LCU切口，将皮肤翻折并远离手术区域。

不要去除皮肤，因为后续将使用精细镊子进行缝合。轻轻将皮肤从目标区域向上提起并拉开。使用洁净的镊子，轻柔地刮除颅骨暴露区域的骨膜。

在颅骨上涂抹少量10%三氯化铁，以彻底干燥骨膜并确保其被完全去除。必须确保颅骨完全干燥。为确保胶水能够良好粘附，需用显微外科刀片轻轻刮除干燥的骨膜组织。

接下来，在不锈钢头板的成像窗口周围涂抹一层薄薄的Sano丙烯酸胶水，并将头板固定在颅骨上。使用棉签棒的木端，将胶水涂抹到成像窗口内部的接缝处，确保填充成像板与颅骨曲率之间的所有间隙。向窗口内滴加一滴胶水加速剂。

然后迅速擦去多余的胶水。待胶水完全干燥后，让其自然干燥。使用装有0.7毫米不锈钢磨头的牙科钻，在成像窗口处开始磨薄颅骨。

交替钻孔并偶尔应用0.9%无菌生理盐水，以避免在颅骨上产生过多热量。通过在颅骨表面进行小范围移动，磨薄一块4×4毫米的颅窗。

使用牙科钻。用钝头镊子测试颅骨的薄度。轻轻施压时，颅骨表面会略有凹陷。

用于成像的最佳颅骨厚度为10至30微米。颅骨变薄后，清除窗口上的所有碎屑，并在颅骨上放置生理盐水。使用安装在解剖显微镜上的数码相机拍摄成像窗口的照片。

此照片中的脑血管结构将有助于确定后续成像过程中成像板的放置位置。将动物转运至双光子成像系统。动物应始终保持在加热毯上，并在整个成像过程中持续监测其体温。

使用配备 mi tai 激光器的双光子显微镜。采用10瓦固态泵浦源以获得最大功率，并配备经过改装的 Olympus flow view 共聚焦单元。该系统针对深层组织成像进行了优化，外部探测器被安装在尽可能靠近物镜的位置，以最大限度地检测来自大脑的荧光信号。使用低数字变倍时，向成像窗口滴加一滴生理盐水。

使用固定在显微镜上的数字相机，识别含有明亮标记神经元的区域。必要时，拍摄成像区域的照片。这是为了在后续时间点能够返回到相同的成像位置。

通过整个大脑可见范围获取低倍镜下的图像序列，以显示树突分支的范围。该图像将用于在后续时间点定位成像区域，包括血管和树突。使用成像软件在幼年和成年动物中维持其结构。

将数字放大倍数提高八倍，必要时调整XY坐标，并采集高倍放大图像序列，以显示包括树突棘位置和结构在内的详细树突形态。记录每次图像序列采集的详细笔记，包括视野坐标、采集范围、Z轴步进大小以及图像序列的步数。这些笔记将在后续时间点重新访问该树突或轴突时使用。

成像后，用镊子轻轻将头板从颅骨表面分离并取下。清除残留的胶水，并用0.9%无菌生理盐水擦拭颅骨。

使用6号缝合线将颅骨上的皮肤缝合。成像操作完成后，用70%乙醇擦拭该区域。将动物置于干净的笼子中，并放置于加热灯下，直至其苏醒并能够活动。

然后将动物放回原来的笼子，以便在之后的任意时间点（从两天到数月不等）再次进行成像。移除缝线并重新打开头部皮肤。采用无菌操作方法，利用首次手术期间获取的脑血管数字图像确定最初的成像位置。随后按照之前的方法重新固定头板。

必要时使用显微外科刀片轻轻削除在成像时间点之间可能再生的任何骨组织。用牙科钻进一步减薄，清除成像窗口的碎屑，并滴加一滴0.9%无菌生理盐水。将动物转移至双光子显微镜，利用前次成像会话中获取的数字荧光图像定位原始成像区域。

启动流式成像程序。打开原始低倍图像，将透明胶片贴附在电脑屏幕上，使用透明胶片专用笔勾画主要血管的分布模式。接着，打开实时图像，并将实时观察到的血管结构与透明胶片上所绘制的模式对齐。

移除透明膜，以重新对八个放大后的结构进行成像。打开先前成像过程中采集的目标图像序列堆栈。将结构描绘到固定在计算机屏幕上的透明胶片上。

从实时图像放大八倍，并将图像与透明度对齐。根据低倍率定位的准确程度，可能还需要轻微调整图像角度，设置平移坐标至第一天的成像参数，包括步长和采集图像数量，Zack重复成像可执行两次。应限制头皮打开次数，以避免破坏颅骨完整性，否则会导致表达GFPM的小鼠成像分辨率下降。

利用体内双光子激光扫描显微技术，可视化了五层部分锥体细胞及其相应的树突结构，图中显示的是GFP标记的视觉皮层树突。该图像为从软脑膜（PIA）开始，每隔5 µm采集一次，直至最终深度175 µm所得图像的投影。方框区域在第0天以更高倍数显示，此处再次展示第4天的同一区域；第0天与第4天树突分支图像的高倍放大视图对比如图所示。

这些图像中，白色箭头头指示稳定的树突棘，红色箭头头指示回缩的树突棘，绿色箭头头指示新形成的树突棘。我们刚刚向您展示了如何利用薄颅骨制备方法在小鼠视觉皮层中进行慢性双光子成像。在进行该操作时，需特别注意在颅骨减薄过程中避免损伤颅骨及下方的硬脑膜，否则将导致成像分辨率下降，同时应详细记录实验过程。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。