一种用于慢性脑成像的开颅手术操作流程

成像技术在脑功能研究中正变得越来越重要。其中，双光子激光显微镜已成为一种极为有用的方法，因为它能够用于研究活体蚂蚁大脑，并在适当制备条件下实现长时间观察。该技术可对同一皮层区域进行持续数分钟至数月的长期观测。

在本视频中，我们展示了一种利用双光子显微镜进行活体长期脑成像的制备方法。今天演示的颅窗制备技术最初由霍华德·休斯医学研究所珍利亚农场研究中心的研究员卡尔·沃达博士开创。我们是来自加利福尼亚大学洛杉矶分校神经病学系卡洛斯·波特·凯约实验室的Hi和Ricardo Must。

今天我们将向您展示用于长期活体成像的颅窗制备方法。这种制备技术非常有用，因为它允许使用双光子激光显微镜对脑组织深部进行成像。现在让我们开始吧。

手术开始前，使用异氟烷对小鼠进行麻醉：诱导麻醉浓度为4%，维持麻醉浓度为1.5%至2%，操作需遵循I-A-C-U-C批准的程序。必须通过尾部或脚趾夹捏反应来确认动物已完全进入麻醉状态。使用啮齿类动物专用剃毛器，将小鼠从颈部背部至眼部的毛发剃除。

剃毛后，将小鼠置于立体定位仪上，身体下方垫有循环水加热毯，温度设定为37摄氏度，并使用耳杆牢固固定头部。随后涂抹眼膏，以防止动物眼睛干涩。接着，皮下注射地塞米松（0.2毫克/千克）和卡洛芬（5毫克/千克）。

为了防止脑组织肿胀或炎症反应。在开始手术前，务必通过使用70%酒精和碘伏交替擦拭皮肤三次来对术区进行消毒。所有手术器械均已使用玻璃珠灭菌器预先灭菌，剪刀则用乙醇喷洒处理。

从头部基底沿水平方向开始切开颅骨顶部的皮肤，接着向吻侧方向做两个切口，几乎到达眼睑处，然后做两个在中线汇合的斜切口。此时，在骨膜上滴加一滴利多卡因和肾上腺素溶液，以避免使用手术刀时出现过度出血或疼痛；随后将骨膜推至颅骨边缘。

颈部后方的肌肉组织也被轻轻牵开。然后用手术刀轻轻刮除整个暴露的颅骨表面，以形成干燥的表面。这一步骤非常重要，因为后续涂抹胶水时，干燥的表面有助于胶水更好地粘附。

选定成像位置后，即可开始制作颅窗。使用气动牙科钻在颅骨上轻轻画出一个直径约四毫米的圆。轻微钻磨后，再次将利多卡因肾上腺素溶液涂抹于颅骨表面。

当仅剩一层非常薄的骨质时停止钻孔，通常为一层鼻骨。通过轻压颅骨开窗区域的中心，感受其在一滴生理盐水下塌陷的程度，并利用骨小梁这一骨组织的海绵状结构，即可达到此阶段。

使用尖端非常细的镊子将颅骨瓣从颅骨上抬起。生理盐水非常重要，因为它有助于抬起颅骨并防止硬脑膜出血。随后将预先浸泡过生理盐水的明胶海绵敷在硬脑膜上，以止住去除颅骨时偶尔出现的少量出血。

在干燥硬脑膜表面并确保无出血后，将一片无菌的5毫米玻璃盖玻片轻轻放置于硬脑膜上方。在颅骨的对侧半球滴加一滴以氰基丙烯酸酯为基础的胶水。借助一根细针，小心地将胶水均匀涂抹于窗周，注意避免将胶水渗入玻璃盖片下方。

现在可以将胶水均匀地薄薄涂抹在整个颅骨表面。待胶水干燥后，混合牙科丙烯酸树脂并涂抹至整个颅骨表面，同时覆盖盖玻片边缘的一小圈区域，以固定盖玻片。固定盖玻片后，使用牙科丙烯酸树脂在窗口周围制作一个小的围堰。

牙科丙烯酸树脂中还嵌入了一根钛棒。该钛棒后续将用于将小鼠牢固地固定在显微镜的载物台上。在成像过程中，必须确保钛棒处于水平状态，以便其与颅窗平行。

在横杆下方放置一张纸片，可使横杆在丙烯酸树脂硬化过程中保持水平。牙科用丙烯酸树脂需固化或硬化10分钟，此时钛制横杆已固定到位。随后将动物置于温暖的笼子中，直至其恢复意识。麻醉恢复后，动物可在同一天进行成像。

本视频展示了使用我们自行研制的双光子显微镜，通过覆盖在三个月大GFPM小鼠体感皮层上的颅窗，以五微米为间隔采集的160幅图像的Z轴堆栈。该转基因小鼠品系仅在少量皮层神经元中表达GFP。图像使用40倍水浸物镜（数值孔径0.8），在910纳米激发波长下拍摄，覆盖皮层第五层以及第二至第三层区域。

在较浅层的图像中，可以清晰地辨认出锥体细胞顶树突的树突分支。每个神经元的顶树突分支汇聚成一条粗大的主干顶树突。从这条主顶树突上还可观察到一些较小的斜行树突，同时视野中也明显可见穿过成像区域的轴突。

这是使用相同的40倍物镜在更高放大倍数下，每隔1.5微米拍摄一张图像，共12张图像的叠加。图像显示了浅表的树突，分辨率足够高，可分辨出单个树突棘。我们刚刚向您展示了如何制备颅窗，以利用光学显微镜对大脑进行长期成像。这是一种极为强大的研究大脑的方法，因为它不仅允许您研究活体大脑的结构和功能，而且能够在单次成像的基础上，进行长达数月的多次成像，实现长期观察。

颅窗制备的另一个优点是能够成像较大的视野，从而可以对整个脑区或跨越数毫米范围的神经纤维网络等大尺度结构进行成像。进行该操作时，务必在尽可能洁净和无菌的条件下进行，并保持手部高度稳定。好的，就这些。

感谢观看，祝您的实验顺利成功。