使用³¹P 核磁共振波谱法评估离体小鼠心脏功能与能量代谢

以下实验的总体目标是观察离体灌注小鼠心脏的心脏功能与能量代谢。通过以LOR模式灌注小鼠心脏实现该目标。第二步使用富含葡萄糖和丙酮酸的Krebs-Henseleit缓冲液，将一个注满水的球囊插入左心室（LV），从而在实验过程中持续监测心脏功能。

接下来，将心脏放入一支10毫米的核磁共振（NMR）管中，并插入磁体，以通过观察磷酸肌酸、三磷酸腺苷（ATP）和无机磷酸盐的共振信号来评估心肌能量代谢。所获得的结果可反映基于左心室（LV）压力波形以及³¹P核磁共振（P-31 NMR）和质谱分析的心脏功能与能量状态。大家好，我是来自华盛顿大学麻醉科MIT代谢研究中心的Steve Kitz。今天我将向您展示一种结合³¹P核磁共振（PNMR）光谱技术的离体心脏灌注实验操作流程。

我们在实验室中使用此方法来评估生物工程小鼠模型的心脏功能和能量代谢。现在我们开始吧。首先，准备一升KRES溶液，即Krebs-Henseleit液或KH缓冲液。

向混合物中通入5%二氧化碳和95%氧气的气泡，持续10至15分钟。然后加入2毫摩尔的氯化钙，随后加入底物，即10毫摩尔葡萄糖和0.5毫摩尔丙酮酸。在这些实验中，每次获取³¹P谱时同时使用两套独立的系统。

一台布鲁克14 T磁体与先进的三控制台相连，并配备装有Top Spin V 2.1软件的计算机，用于评估心脏功能。一个定制的心脏灌注系统与PowerLab连接。四通道30数据采集。

配备用于数据分析的 Lab Chart PRO Six 软件。心脏灌注装置包括一个由 STH 泵控制器控制的 Mini Pulse Three 蠕动泵，用于将 KH 缓冲液灌注到心脏中。在核磁共振（NMR）实验过程中，心脏温度的调控至关重要。使用加热循环器将温度维持在 37.0 至 37.5 摄氏度之间，当心脏位于磁体内部时，通过光纤温度探头在整个实验过程中持续监测温度。

在整个实验过程中，通过连接到数据采集系统的压力传感器监测左心室压力和灌注压力，并使用配套软件进行显示。采用生理学传感器监测左心室压力，使用一次性血压传感器监测灌注压力。最后，通过脐带向心脏供应加热的含氧缓冲液。

进入磁体后，在实验开始之前，首先使用标准水银柱压力计对压力传感器进行校准。将传感器置于无压力状态，进行零点校准。然后将该水银柱压力计充气至较高压力，将此数值输入计算机程序中。

然后，通过将此 fig moment 压力计充气至已知压力，并在计算机屏幕上验证其读数，确认压力传感器已得到充分校准。压力传感器校准完成后，使用含有 150 毫摩尔磷酸钠标准样品的 10 毫米核磁共振（NMR）管对 NMR 探头进行校准。使用 TopSpin 软件程序执行校准。

首先，调节样品以设定磷共振的频率。然后对样品进行匀场，以产生均匀的磁场。此初始校准有助于增强信号，并缩短开始采集信号所需的时间。

将小鼠置于探针内以开始小鼠心脏提取后，向小鼠腹腔注射200单位肝素，以减少凝血。五分钟后，腹腔注射175毫克/千克戊巴比妥钠。待小鼠麻醉后，将其仰卧放置，并用胶带固定四肢，以暴露胸部区域。

通过夹捏脚趾确认小鼠已完全麻醉。用剪刀切开腹腔和胸腔，用镊子掀开肋骨，暴露胸腔。用镊子夹住肺组织，用弯剪轻轻提起心脏。

在心脏后方切断大血管，并缓慢向小鼠头部方向继续操作，直至心脏完全游离。立即用冰冻的KH缓冲液停止心脏活动。将器官保持在冰上，并迅速取出肺脏。

辨认胸腺的叶，并轻轻将其掀开以暴露主动脉。随后去除胸腺。最后，仔细清除周围组织，分离出主动脉。

使用显微缝合镊子，通常夹住主动脉的两壁以暴露管腔。然后小心地将主动脉套入导管上。导管由外径为0.965毫米的聚乙烯管制成。

用微血管夹固定主动脉，并迅速在主动脉周围结扎缝线。缝线打结后，移除血管夹。使用镊子仔细检查确保套管位于主动脉根部上方。

添加任何必要的缝线以固定心脏位置。使用镊子和显微剪刀去除多余的组织。然后在左心耳处做一个小切口。

轻轻握住心脏，小心地将外径为0.61毫米的聚乙烯导管经左心房、左心室腔插入，并从心尖穿出。剪去多余的导管。接着，将一个未充气的注水球囊经心房插入左心室。

使用胶带固定气球的位置。然后逐渐增加蠕动泵的转速，以向心脏提供足够的灌注流量。以相当于每分钟约两毫升的恒定流速持续用KH缓冲液灌注心脏，直至将心脏放入核磁共振探头中。

使用微量注射器向左心室（LV）球囊注入少量液体，以验证用于核磁共振（NMR）波谱分析的左心室压力换能器是否正常工作。首先，小心地将心脏插入一支10毫米的NMR管中。在NMR管周围放置一个宽口旋转器，以帮助引导NMR管进入正确位置。

在探头内，用胶带将整个装置牢固地固定在脐带上。接着，缓慢地将脐带放入磁体的上部孔径中，直至装有心脏的核磁共振（NMR）管进入10毫米NMR探头的线圈内。当心脏在探头内处于正确位置后，调节寄生泵的流量，以达到80毫米汞柱的灌注压力。

通过启动泵控制器上的保持机制来维持灌注压力。让心脏经历15至20分钟的平衡期。在平衡期间，调整左心室球囊的容积，使舒张末期压力达到8至10毫米汞柱。

然后优化光谱仪参数，以获得尽可能强的磷信号。通过设置射频脉冲来调节核磁共振仪器，使脉冲频率与磷原子核的共振频率一致。在平衡期结束后，对样品进行匀场，以使磁场均匀。

开始采集多个磷-31核磁共振（P 31 NMR）谱图。每次谱图采集的时间取决于磁体场强、样品大小以及特定实验所需的信噪比。本实验中使用14特斯拉磁体，通过累加256次射频脉冲信号获得谱图，每次脉冲持续20微秒，翻转角为60度，脉冲间延迟时间为2.0秒。

本实验大约需要10分钟。左心室发展压是评估心脏功能的常用指标，通过将收缩压减去舒张末期压力（EDP）得到。在舒张末期压力固定为8至10毫米汞柱的情况下，正常C57黑鼠的左心室发展压通常介于100至110毫米汞柱之间。

图中显示了对照组和主动脉结扎小鼠的代表性压力-容积曲线。收缩功能通过左心室（LV）发育压随左心室容积增加的变化来表示，左心室容积由左心室球囊的容积确定；舒张功能通过左心室舒张末期压（EDP）随左心室容积增加的变化来表示。

离体灌注小鼠心脏的磷-31核磁共振（P 31 NMR）谱图可提供磷酸肌酸（PHOSPHOCREATINE或PCR）、三磷酸腺苷（a TP）中的三个磷酸基团以及无机磷酸盐（pi）的信号。在此图谱中，无机磷酸盐（PI）峰相对较小，这是以丙酮酸或脂肪酸为底物供能的有氧灌注心脏的典型特征。

除了缺血期间的葡萄糖外，该峰升高时，PCR峰则降低。我刚刚向您展示了如何准备小鼠心脏以进行灌注，从而在实验期间同时测量心脏功能和能量代谢。确保心脏得到充分灌注非常重要。

否则，您的核磁共振数据将不可靠。以上就是全部内容。感谢您的关注，祝您的实验顺利成功。