使用染色质免疫共沉淀进行全基因组分析以鉴定亚型特异性基因靶点

以下实验的总体目标是鉴定组蛋白去甲基化酶KDM5A-JARID1A和RBBP2所作用的基因组靶点。该目标通过以下步骤实现：首先制备交联染色质，并通过超声处理将其打断为合适大小的DNA片段；随后，使用RBBP2抗体对与RBBP2结合的DNA片段进行免疫沉淀。

接下来，通过PCR扩增回收的基因组DNA以进行测序。最后，将Illumina测序获得的短读长序列唯一比对到人类基因组，并将显著的峰注释到最近的基因。为了鉴定RbbB2的靶基因，基于全基因组范围内RbbB2富集区域的鉴定结果，获得显示与RrbB2靶基因相关的分子功能的数据。

您好，我是 Mike，来自芝加哥伊利诺伊大学生物化学与分子遗传学系 Elizabeth Bencia 博士的实验室。我是 ala，来自 BARCEL 生物医学研究园大学 PO P fea 的 NGA 博士领导的生物医学基因组学实验室。

我是 Danielle Dal，这位是 William Richter。我们俩都在仁心技能实验室工作。

今天我们将向您展示一种染色质免疫沉淀测序的实验方法。我们在实验室中使用该方法来研究组蛋白修饰的结合位点。现在让我们开始吧。

开始此实验步骤时，培养约 10 的 8 次方个细胞，用于每次免疫沉淀（ip）。此处为弥散性溶骨性淋巴瘤。

使用U 9 37细胞，并在细胞生长后用TPA诱导单核细胞分化96小时，随后向培养基中直接加入甲醛溶液，使其终浓度为1%。轻轻摇动培养瓶片刻，室温静置10分钟。然后吸除培养基，用15毫升预冷的PBS冲洗细胞。重复此洗涤步骤一次。

接下来，向冰上的每个烧瓶中加入6毫升裂解缓冲液一。然后在4°C下轻轻摇动烧瓶20分钟。最后，使用细胞刮刀收集细胞，并将其转移至15毫升锥形管中。

此时，细胞可在 -80 摄氏度下保存。如果细胞已冷冻，请将其融化。融化后，离心收集细胞，并弃去上清液。

然后将细胞重悬于6 mL裂解缓冲液二中，在室温下轻轻摇动离心管10分钟。重复离心操作，并将细胞重悬于2.5 mL裂解缓冲液三中。接下来，将悬液置于冰水浴中的烧杯内，使用Branson 450超声破碎仪，设置微探头振幅为50%至60%，准备进行超声处理。

将溶液进行32秒的持续超声处理，并在冰上冷却。重复此脉冲处理10至15次，每次持续1分钟，然后用移液器将管内液体上下吹打混匀，转移至新管。继续对溶液进行脉冲处理并冷却。

超声处理后，再额外进行五次，每次向溶液总体积的十分之一中加入10%的Triton X-100。然后将裂解物转移至1.5毫升离心管中，在进行染色质免疫沉淀或芯片分析之前，使用微量离心机离心去除碎片。保留50微升细胞裂解物作为输入样品。

然后将澄清的细胞裂解液与预先按照书面实验方案制备的、结合有抗体的磁珠混合。将混合物与50 µL的输入样品一起在4°C下轻轻摇动过夜。用1 mL洗涤缓冲液洗涤磁珠。

然后使用磁力架收集磁珠，并移除上清液。此洗涤步骤重复六到八次。最后用一毫升含50毫摩尔氯化钠的TE缓冲液进行一次终末洗涤。

离心后，在微量离心机中旋转磁珠，吸去残留的TE缓冲液。然后向样品中加入100 µL洗脱缓冲液。立即进行下一步操作。

将样品在 65 摄氏度孵育 10 至 15 分钟。每两分钟用试管在 1.5 毫升管架上刮擦一次，以保持珠子悬浮。使用离心机和磁力架收集珠子，并将上清液转移至 PCR 管中。

然后取出先前保存的输入样品，加入三倍体积的洗脱缓冲液。最后将免疫沉淀样品和输入样品放入热循环仪中，在65摄氏度下孵育过夜。次日，为逆转交联，向样品中加入一倍体积的TE缓冲液。

然后加入RNAs A，使其终浓度为0.2微克每微升。将样品在37摄氏度的热循环仪中孵育1至2小时。孵育结束后，加入蛋白酶K，使其终浓度为0.2微克每微升。

然后将样品在55摄氏度的热循环仪中孵育2小时。接着用一个体积的苯酚抽提样品一次。再用一个体积的苯酚-氯仿-异戊醇抽提样品第二次。

最后，用等体积的氯仿-异戊醇再次提取样品。然后向每个样品中加入 30 微克的糖原。同时，将氯化钠加入样品中，使其终浓度为 0.2 摩尔，并加入两倍体积的乙醇。

在负80摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，离心样品并弃去上清液。用500微升75%乙醇洗涤沉淀，然后将沉淀干燥，并重悬于40微升水中。

为了检测超声处理（SONICATION）程序产生的DNA片段大小，将五微克纯化的输入样品加入1.8%琼脂糖凝胶中并进行电泳。超声处理应产生长度在150至350个碱基对之间的片段。然而，如果片段大小不在该范围内，则应在扩增基因组DNA之前，通过调整脉冲次数和振幅来优化超声处理程序。

按照书面方案中所述，检测样品的大小、浓度和富集情况。开始基因组DNA扩增时，取34微升IP样品和200纳克输入样品。使用Illumina基因组DNA文库制备试剂盒，按照书面方案所述，对DNA片段进行末端修复、加尾及接头连接。

使用小型离心柱PCR纯化试剂盒纯化DNA，然后用预热至50摄氏度的EB缓冲液洗脱。IP和input DNA样本分别使用23微升和46微升。取23微升DNA进行PCR反应，加入25微升融合引物和试剂盒中的DNA聚合酶。

取1 µL浓度为20 µM的sole PCR一和1 µL浓度为20 µM的sole PCR二，按照书面实验方案所述进行PCR反应。PCR扩增完成后，使用Qiagen mini loop PCR纯化试剂盒纯化DNA。

将15微升缓冲液EB预热至50摄氏度，取0.5微升样品进行1:4稀释，使用NanoDrop测定以纯化扩增产物。使用HPLC级水配制50毫升1.8%琼脂糖凝胶，待琼脂糖完全融化后加入TAE和溴化乙锭。然后倒入凝胶，上样电泳。

向输入样品和免疫沉淀样品中加入4 µL上样缓冲液后，在120伏电压下电泳45分钟。电泳结束后分析凝胶结果，应显示产生大小在150至350碱基对之间的片段。

它们代表长度在50至250个碱基对之间的基因组DNA片段。使用手术刀切下凝胶中包含150至350个碱基对范围内物质的区域。注意避免切下位于约120个碱基对处的接头二聚体条带。

按照制造商的说明，使用Kayak快速凝胶回收试剂盒回收DNA。在无加热条件下，使用浓缩仪将样品精确浓缩至11微升。取1微升样品，使用NanoDrop分光光度计测定DNA浓度。

最后，使用Illumina基因组分析仪鉴定富集的基因产物，并按照书面实验方案中所述分析结合位点和靶基因。鉴定出的富集RB结合蛋白2（RBP2）结合区域的基因组坐标以按染色体划分的格式呈现。染色体上基因集合的占据情况可可视化为黑色VARs。

此处显示了10号染色体上的占据情况，rbp两个结合区域以垂直线表示。中间图显示了rbp两个异构体在10号染色体上的所有结合区域，底部图显示了rbp两个大异构体的结合区域。该信息提供了rbp两个异构体在10号染色体上重叠及特异性占据的总体概况。

此处显示了一个热图，展示了在 RBP 结合的基因中，经错误发现率（FDR）校正后显著富集的基因本体（GO）分子功能类别。越接近红色的两种颜色表示统计学显著性越高；黄色表示统计学显著性较低，灰色表示无统计学显著性。

富集分析显示了R BP两个靶基因的重叠及亚型特异性分子功能。我们刚刚向您展示了如何在此过程中鉴定转录因子结合位点。产生适当大小范围和产量的DNA片段至关重要。

这可以通过在超声处理步骤中遵循我们的指南来实现。就这样。祝您的实验顺利，感谢观看。