通过enChIP技术分离特定基因组区域及鉴定其相关分子
2016年1月20日
为了理解特定基因组功能区域的调控机制，需要鉴定与这些区域相关的分子。本实验方案描述了利用人工设计的DNA结合分子介导的染色质免疫沉淀（enChIP）技术，来鉴定与特定基因组区域相关的蛋白质和RNA的操作步骤。
本实验的总体目标是分离特定的基因组区域，并保留其分子相互作用，以鉴定与该基因组区域相互作用的分子。该方法有助于回答基因组功能领域的相关问题，例如转录及表观遗传调控。该技术的主要优势在于能够直接鉴定与特定基因组区域相互作用的分子。
演示该实验步骤的是来自我实验室的助理教授 Toshitsugu Fujita。根据文本方案，构建目标 DNA 结合分子。这包括生成目标 gBlock 序列，并将其插入逆转录病毒中，例如用于产生与三个 FLAG-dCas9 结合的向导 RNA 复合物。
或者，可生成三种识别目标序列的FLAG-TAL蛋白。随后，按照文本方案用制备好的逆转录病毒感染细胞。验证人工设计的DNA结合分子的表达，并建立细胞系。
接下来，使用甲醛对细胞进行交联。将2000万转染的细胞重悬于30毫升常规培养基中，并加入810微升37%甲醛，使终浓度为1%。在37摄氏度孵育5分钟。5分钟后，加入3.1毫升1.25摩尔甘氨酸以终止交联反应。
将细胞在室温下静置10分钟后再进行后续操作。接着，将细胞管在预冷的离心机中以300 G离心5分钟。小心弃去上清液，并用30毫升PBS重悬细胞沉淀，通过混匀和离心进行洗涤。
进行两次 PBS 洗涤。如有需要，固定后的细胞沉淀可在 -80 °C 条件下保存。接下来，从细胞中收集染色质。
将它们重悬于10毫升裂解缓冲液中，在冰上孵育10分钟。然后，使用预冷的离心机收集细胞，并小心弃去上清液。接着，将细胞沉淀重悬于核裂解缓冲液中，在冰上孵育10分钟。
孵育期间每隔几分钟短暂涡旋混合液一次。再次通过离心收集细胞。随后用10毫升PBS洗涤沉淀，并通过另一次离心去除洗涤液。
这一步可获得染色质组分，如有需要，可迅速冷冻并在负80摄氏度保存。接下来，将染色质沉淀重悬于800微升改良裂解缓冲液三中，并将悬液转移至较小的1.5毫升离心管中。然后，开启超声破碎探头，设置功率为三级，持续工作模式。
为片段化染色质，手动循环进行10秒超声处理和20秒冰上冷却。每进行5到6个循环后，将冰上冷却时间延长至2分钟，以防止样品过热。重复此超声循环10至18次，操作时保持探针尖端不接触管底，以避免样品起泡。
超声处理后，使用快速冷藏离心收集样品。然后，将含有片段化染色质的上清液转移至新管中，并弃去沉淀。有关如何评估片段化效果，请参见文本方案。
为进行免疫沉淀，首先将抗体与Dynabeads偶联。该免疫沉淀实验的规模适用于来自2000万细胞的样品。向片段化的染色质中加入1/5体积含Triton X-100的改良裂解缓冲液三，使Triton的终浓度为1%。
接下来，将混合物加入与正常小鼠 IgG 偶联的磁珠中。在旋转仪上于冷藏条件下孵育反应体系1小时。随后，将磁力架置于溶液上吸附磁珠3分钟。
然后，收集上清液。将上清液转移至连接有抗FLAG抗体的磁珠管中。在4°C条件下，于旋转仪上孵育过夜进行偶联反应。
第二天早晨，将磁铁置于管子上保持三分钟，以收集磁珠。然后用移液器吸出上清液并弃去。现在，洗涤磁珠。
将它们悬浮于1毫升低盐缓冲液中，在4°C条件下于旋转仪上孵育5分钟。孵育结束后，通过磁力分离收集珠子，并弃去上清液。用低盐缓冲液再重复洗涤步骤一次。
采用相同技术，使用高盐缓冲液再进行两次洗涤。随后继续用该方法，以氯化锂缓冲液洗涤磁珠两次。最后，用 TBS-IGEPAL CA-630 缓冲液洗涤磁珠一次。
经过七次洗涤步骤后，将磁珠重悬于 200 µL 洗脱缓冲液中，37 °C 孵育 20 分钟。然后通过磁力吸附磁珠，将上清液收集至新离心管中。重复此洗脱步骤以提高得率。
然后，纯化约5%的DNA以估算产量。首先将大部分洗脱液加入沉淀反应体系中，在负20摄氏度下过夜沉淀染色质。
第二天，将样品离心并弃去上清液。用1毫升70%乙醇冲洗沉淀，再以10分钟离心重复一次。然后弃去上清液，将沉淀重悬于40微升2x上样缓冲液中。
现在，将悬浮液涡旋振荡充分5分钟。然后，在100摄氏度下孵育30分钟，以变性并逆转交联。煮沸后，取40微升样品进行SDS-PAGE凝胶电泳。
通常采用4%至20%的梯度凝胶。电泳至染料迁移至加样孔下方约1厘米处。然后对凝胶进行染色，并将其切成约2毫米长的五段。
将蛋白质从凝胶条带中稀释出来，并用于质谱分析。RNA 的纯化及其后续的测序分析步骤详见文本方案。总体而言，使用 enChIP 方法可纯化多达 10% 的目标基因组区域。
此处显示的是针对 IRF-1 基因启动子区域的分析产量，与非特异性 Sox2 位点进行比较的结果。另一个例子是端粒靶向与非特异性 γ-卫星位点的比较。通过 enChIP SILAC 鉴定出若干与 IRF-1 启动子相关联的蛋白质，这些蛋白质具有干扰素 γ 特异性。
通过结合质谱分析的enChIP技术，还鉴定了端粒结合蛋白。随后利用enChIP RNA测序技术鉴定与端粒相关联的RNA。该技术问世后，为转录和表观遗传调控领域的研究人员探索各种生物系统中的相关机制铺平了道路。
概述
本方案概述了通过工程化DNA结合分子介导的染色质免疫沉淀（enChIP）技术，用于鉴定与特定基因组区域相关的蛋白质和RNA。该方法提供了分离分子相互作用的详细流程，对于理解基因组功能至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因组学
- 表观遗传学
- 分子生物学
背景
- 了解分子与基因组区域的相互作用对于阐明调控机制至关重要。
- enChIP技术可直接鉴定与特定基因组区域相互作用的分子。
- 该方法适用于转录和表观遗传调控的研究。
- 它增强了研究复杂基因组功能的能力。
研究目的
- 分离特定基因组区域并鉴定相互作用的分子。
- 提供一种可靠的方法用于研究转录调控和表观遗传调控。
- 有效演示enChIP技术的操作与应用。
使用的方法
- 使用 gBlock 序列和逆转录病毒构建 DNA 结合分子。
- 交联细胞并分离染色质。
- 通过超声处理将染色质片段化。
- 使用偶联抗体进行免疫沉淀。
主要结果
- 成功从转染细胞中分离染色质。
- 鉴定与特定基因组区域相关的蛋白质和RNA。
- 通过enChIP技术有效纯化目标基因组区域的验证。
- 通过质谱分析评估产物得率。
结论
- enChIP 是一种用于研究特定基因组位点分子相互作用的强大工具。
- 该方法可揭示转录调控和表观遗传调控的机制。
- 它可用于基因组研究中的多种应用。
常见问题
行业应用价值
enChIP 能够直接且无偏倚地鉴定与特定基因组区域相互作用的蛋白质和 RNA，有助于在靶点验证过程中进行机制层面的风险评估。该方法通过将基因组位点与转录及表观遗传调控中的功能性分子相互作用关联起来，提高了预测的可信度。它为早期发现生物学研究提供了一种可扩展的方法，可用于指导项目筛选，降低后期生物学风险。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过鉴定目标基因组区域的直接分子互作因子，验证治疗假设。
- 操作价值：通过无偏倚的蛋白质组学和转录组学分析，实现功能靶点的验证。
- 预测价值：通过阐明通路背景和调控机制，支持作用机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：为下游分子相互作用筛选制备经过验证的染色质输入样本。
- 操作价值：采用可量化的得率标准化特定基因组区域的分离（纯化效率最高可达10%）。
- 可扩展性：通过TAL或CRISPR-dCas9工程技术，可在不同基因位点（如启动子、端粒）重复使用该平台。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过鉴定相关分子，将发现阶段的基因组学发现与疾病相关的机制联系起来。
- 转化连续性：通过对分离复合物进行质谱或RNA测序，实现与生物标志物相匹配的后续研究。
- 风险调整的推进：通过揭示特定环境下的相互作用分子（例如干扰素γ特异性的IRF-1关联），指导临床前靶点的优先筛选。
流程与工作流整合
enChIP 适用于从靶标假设验证到先导物鉴定的整个发现过程，提供分子相互作用数据，连接基因组注释与功能验证。
- 发现生物学：通过分离基因组区域并同时保留天然分子相互作用，支持假设验证。
- 筛选：生成适用于检测的染色质组分，用于在化学或遗传扰动条件下进行相互作用分析。
- 分析：通过质谱或RNA测序读数，实现不同条件下相关分子的定量比较。
- 转化研究：通过鉴定出的蛋白质和RNA，将基因组位点与表型机制关联起来。
- 企业级复用：在多个项目中建立标准化的能力，用于位点特异性的相互作用组作图。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接鉴定相互作用分子，减少基因组功能研究中的机制模糊性。
- 操作价值：利用基于抗体的免疫沉淀技术，实现标记基因组区域的可重复、标准化分离。
- 战略价值：在发现流程早期验证靶点作用机制，从而优化“继续/终止”决策。
- 项目组合影响：基于基因组靶点的分子背景，实现风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备分子克隆方面的专业知识，以构建TAL或gBlock-CRISPR DNA结合分子。
- 需要具备超声处理设备、磁性分离工具以及下游分析技术（如质谱、RNA-seq）的使用条件。
- 要求跨团队在表位标记（如FLAG）和抗体偶联工作流程方面实现标准化。
- 必须考虑染色质可及性以及不同基因组区域和细胞类型中表位的效率差异。
- 实际限制：效率取决于在靶细胞中成功标记并表达所构建的DNA结合分子。
