通过EdU信号扩增在单个细胞中可视化线粒体DNA复制

本实验的总体目标是对培养神经元中的线粒体DNA（M-T-D-N-A）复制进行标记和可视化观察。首先将神经元与胸腺嘧啶类似物EDU共同孵育2至24小时；第二步是通过铜催化的共价反应，利用荧光染料Alexa Fluor 488叠氮化物对掺入的含炔基EDU进行标记。

该实验步骤的最后一步是通过芳酰胺信号放大步骤来扩增俄戈绿信号，以便可视化新合成的线粒体 DNA 中掺入的 EDU。最终，通过点击化学 EDU 标记与后续的撕膜信号放大相结合，可以获得显示神经元特定亚细胞区域中线粒体 DNA 复制的结果。该技术相较于现有方法（如 BRDU 标记）的主要优势在于，EDU 标记操作更简便、条件更温和，因而允许对神经元标志物进行额外的免疫荧光染色。

该方法可以解答线粒体数量调控中的关键问题，例如神经元如何满足其亚细胞区室（包括胞体、轴突、树突和突触终末）中变化的能量需求。因此，该方法有助于揭示多种线粒体相关神经系统疾病（如神经病和神经退行性病变）发病机制的潜在机理。但更重要的是，该方法还可应用于其他线粒体DNA拷贝数变化可能介导疾病状态发生的系统，包括药物毒性、癌症和衰老。

本视频将演示如何对生长在无菌12毫米玻璃盖玻片上的背根神经节神经元中新合成的线粒体DNA（缩写为mtDNA）进行标记。在24孔培养板中，将Click-iT EdU微孔板检测试剂盒中的10毫摩尔储备液5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（缩写为EdU）用培养基按1:100稀释，配制成10× EdU储备液。随后将10× EdU储备液直接加入各孔培养基中，将处理后的神经元置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育2至24小时。

在室温下用 2% 多聚甲醛固定神经元 10 至 15 分钟。用 1× PBS 洗涤两次，每次洗涤 2 至 5 分钟。固定后的神经元可在新鲜的 1× PBS 中于 4 摄氏度保存长达一个月。

按照随附文本所述准备一个湿盒。使用尖头镊子将28个固定的盖玻片（包括EDU阳性和阴性对照）转移至湿盒内多聚甲醛疏水片上。重新加入200至300微升的1×PBS，以覆盖每个盖玻片的表面。

按照文中所述及试剂盒制造商的说明书准备 Click-It 检测试剂盒，用于标记线粒体 DNA。向每个盖玻片中加入 75 至 80 微升含有 0.1% Triton X 的 1× PBS 通透溶液，覆盖盖玻片并室温孵育 10 分钟。使用带有 200 微升吸头的移液球连接末端，轻柔地移除液体，避免细胞丢失。

使用移液管轻轻将盖玻片淹没。加入 200 至 300 微升的 1×PBS，彻底洗去之前的溶液。每张盖玻片清洗两次。

在每张盖玻片上的一倍磷酸盐缓冲液（XPBS）中加入75至80微升新鲜的1%过氧化氢。室温下避光孵育30分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。用一倍磷酸盐缓冲液（XPBS）冲洗两次，方法同前。随后，按照随文所述步骤新鲜配制点击反应混合液。

上下吹打混匀。每张盖玻片加入75至80微升Click-iT EDU固定剂，对神经元进行后固定，室温孵育5分钟。在后固定孵育期间，用等体积的Click-iT EDU固定剂稀释反应混合液。

将反应混合液加入每个盖玻片上，避光，室温孵育25分钟。在落射荧光显微镜下，用稀释的一倍封闭缓冲液轻轻洗涤反应混合液两次。当EDU染色完成后，在细胞核中检查异硫氰酸荧光素（orgon green）染色情况。

开始进行原位杂交信号放大（TSA），向每个盖玻片加入1% TSA封闭液，在室温下孵育30分钟。将预先在2至24小时前配制的抗绿色辣根过氧化物酶偶联抗体原液短暂离心，用TSA封闭液按1:300稀释一抗，通过翻转或移液器吹打混匀，避免涡旋震荡。向每个盖玻片加入75 µL稀释后的抗体溶液，在4°C条件下孵育过夜。

第二天，在室温下用一倍浓度的 XPBS 洗涤三次。将盖玻片在最后一次洗涤中继续孵育额外的 30 至 60 分钟，以确保去除未结合的一抗。在使用前，立即根据本方案的文字部分配制 IDE 反应体系。

将盖玻片在室温下与IDE反应液孵育15分钟。用1×PBS洗涤三次，最后一次洗涤孵育30至60分钟，操作同前，在显微镜下观察。检查MT DNA标记情况，使用含DPI的ANTIFA封片剂将成功染色的神经元封固于玻片上。此处显示的是胚胎期和成年背根神经节神经元的代表性微分干涉相差图像，这些图像通常用于分析。

这些示意图展示了使用绿色荧光信号标记 MTD NA 中 EDU 的操作流程。有丝分裂活跃的 F 11 神经母细胞瘤细胞作为阳性对照，展示了 EDU 在细胞核 DNA 和线粒体 DNA 中掺入后的标记模式，这些代表性荧光图像与明场图像叠加显示。绿色的点状信号显示了被扩增的 EDU 信号，该信号已掺入到胚胎期和成年期背根神经节神经元新合成的 M-D-D-N-A 中。

EDU标记步骤可随后用于对神经丝蛋白等神经元标志物进行红色免疫荧光染色。这些示意图展示了使用红色荧光信号标记EDU和线粒体DNA（MTD NA）的操作流程。有丝分裂活跃的F 11神经母细胞瘤细胞作为阳性对照，显示了EDU掺入细胞核DNA和线粒体DNA后的标记模式。

该示意图展示了使用绿色或红色荧光信号对新合成的线粒体DNA（M-T-D-N-A）进行BrdU标记的操作流程。在进行该实验时，重要的是需使用有丝分裂活跃的细胞设置对照，以在进入扩增步骤以可视化线粒体DNA标记之前，确认EdU标记及细胞核染色的成功。在完成该流程后，还可进一步开展其他实验方法，例如标准免疫荧光染色，以探究线粒体DNA合成在特定神经元亚群或神经元特定区室中的调控机制。由于该技术的发展，神经生物学领域的研究人员将能够借助正常生理状态的培养模型以及模拟疾病损伤的培养模型，深入探索线粒体数量的调控机制。

神经系统状态。