研究核细胞周期激酶Cdk1在线粒体定位与功能的实验方法

以下实验方案的总体目标是确定一种通常位于细胞核内的细胞周期激酶在线粒体内的亚线粒体定位，并进一步分析该蛋白的线粒体定位如何影响细胞周期的进程。该方法有助于解答线粒体研究领域中的关键问题，例如细胞核在细胞周期过程中如何与线粒体进行通讯。通过将蛋白质与线粒体靶向序列进行标记，我们可以实现该蛋白在线粒体中的特异性过表达，从而研究其在线粒体内的特异性功能。

尽管该方法可用于研究特定蛋白质向线粒体的靶向运输，但也可应用于其他细胞器，如细胞核、内质网、高尔基体和溶酶体。根据文本方案完成细胞培养、匀浆和离心后，将上清液转移至新离心管中，并在 4 摄氏度条件下以 7,000 g 离心 10 分钟。

然后用 200 µL 冰冷的 IBC 缓冲液重悬沉淀，并将匀浆液分成两等份。在 7,000 ×g、4 °C 条件下再次离心 10 分钟，重复洗涤一次。

弃去上清液后，向其中一个沉淀中加入 30 微升细胞裂解缓冲液，并将裂解物在 -80 摄氏度保存，用于免疫印迹分析。为了利用第二个沉淀进行碳酸钠提取以分离可溶性蛋白和膜结合蛋白，加入 250 微升 0.1 摩尔碳酸钠（pH 11.0），冰上孵育 30 分钟。然后在 100,000 ×g 离心 20 分钟。

然后收集上清液，并加入等体积新配制的20%三氯乙酸以沉淀蛋白质。冰上放置30分钟。在此期间，向沉淀物中加入30微升细胞裂解缓冲液，按照文本方案进行超声处理，随后于80摄氏度保存，用于免疫印迹分析。

在30分钟TCA孵育后，以15,000 g离心反应液10分钟。弃去上清液，然后用80 µL细胞裂解缓冲液重悬沉淀。按照文本方案所述分离得到细胞线粒体组分后，将线粒体组分均分为10份。

在 7,000 g 及 4 摄氏度条件下离心样品 10 分钟。使用 30 微升含不同浓度的低渗蔗糖缓冲液（含或不含胰蛋白酶）溶解各沉淀物，并在冰上孵育 30 分钟。

向含有胰蛋白酶的离心管中加入 3 微升 10 毫摩尔的 PMSF，以终止胰蛋白酶消化反应。然后在冰上孵育 10 分钟。在 4 摄氏度、14,000 g 条件下离心样品 10 分钟。

将上清液转移至新离心管中。为裂解沉淀，加入30 µL细胞裂解缓冲液。按照文本方案中所述进行超声处理，并于-80 °C保存。

构建靶向线粒体的GFP/RFP标记的cyclinB1-Cdk1载体时，采用标准分子克隆技术，从人细胞色素c氧化酶亚基8A前体中克隆线粒体靶向序列，并将其插入pEGFP-N1或pERFP-N1载体的NheI和BamHI位点，与GFP或RFP的N端读码框连接。根据文本方案中列出的引物，采用标准技术扩增Cdk1和cyclinB1基因，随后用BamH1酶切PCR产物。

将反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，然后使用剃刀切下正确大小的DNA片段。接着使用凝胶回收试剂盒纯化DNA。随后，在37°C条件下，用1微升BamH1酶消化1微克MTS-pEGFP-N1和MTS-pERFP-N1质粒2小时。

然后加入1 µL小牛肠碱性磷酸酶，在37°C下孵育30分钟。将消化产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，并按照前述方法纯化DNA后，使用文本方案中列出的试剂设置连接反应。随后将反应体系在4°C下孵育过夜。

将10微升连接混合物转化入大肠杆菌DH5-α感受态细胞中，并在含有10毫克/毫升卡那霉素的LB琼脂平板上于37摄氏度过夜培养细菌。

第二天，使用无菌的移液器吸头从平板上挑取一个菌落，并将吸头插入含有 5 毫升 LB 卡那霉素的离心管中。将培养物过夜培养，次日早晨按照说明书中的方案，使用质粒小提试剂盒提取质粒。

转染指数生长期的MCF-10A细胞时，使用Cdk1或cyclinB-1质粒，按1:2的比例在100微升无血清和抗生素的培养基中制备质粒转染试剂。转染细胞后，在37摄氏度下孵育48小时。根据文本方案对线粒体进行染色和观察。

进行细胞分选时，将2 × 10⁵个细胞接种于6孔板中，使用DNA与转染试剂按1:2比例在2.5 mL无血清和抗生素培养基中制备的混合物进行两次转染。转染后在培养箱中孵育48小时，根据文本方案，利用流式细胞术对稳定表达GFP标记的Cdk-1和RFP标记的cyclinB1蛋白的活细胞进行分选。为通过EdU标记的流式细胞术检测细胞周期长度，将分选后的细胞以每孔2.5 × 10⁵个细胞的密度接种至6孔板中。

过夜培养后，向培养基中加入EdU，终浓度为25 µM，继续孵育1小时。随后每隔2小时，用500 µL含1% BSA的PBS洗涤一个细胞孔，并将细胞收集至1.5 mL离心管中。

将细胞在350 ×g离心5分钟。然后弃去上清液。加入100 µL固定液重悬沉淀。

充分混匀，室温孵育15分钟。接着，用1毫升含1% BSA的PBS洗涤细胞三次。然后，用0.5毫升70%乙醇在4°C条件下固定细胞过夜。

在对转染了GFP和RFP标记蛋白的细胞进行EdU标记时，淬灭GFP和RFP的荧光信号至关重要。为实现这一目的，我们增加一步使用70%乙醇进行过夜固定的步骤。次日，按照文本方案洗涤并通透细胞后，向每管中加入0.5毫升反应混合液，并充分混匀。

避光孵育并再次洗涤后，使用含1% BSA的PBS配制的50微克/毫升碘化丙啶（propidium iodide，PI）对DNA进行染色。通过流式细胞术分析EdU阳性细胞群体。展示经DNA含量和EdU染色的EdU标记细胞的散点图。

使用APC通道检测Alexa 647 EdU，配备670/30带通滤光片，允许所有低于685纳米的光通过该滤光片；使用藻红蛋白通道检测PI，前方配备581/15带通滤光片，允许所有低于600纳米的光通过该滤光片。采用标准设门策略进行数据采集，首先以FSC面积对SSC面积作图以分析细胞形态，随后以PI对Alexa 647 EdU作图以分析细胞染色情况。依次记录所有试管的数据，每份样本采集10,000个事件。

在此图中，线粒体基质蛋白 Hsp60 和膜间隙蛋白 Timm13 被用作线粒体亚结构定位标志物。与 Hsp60 相似而不同于 Timm13，cyclinB1 和 Cdk1 能抵抗胰蛋白酶消化，表明它们定位于线粒体基质。如图所示，通过分离的线粒体组分的 Western 印迹分析，利用带有 MTS 和 GFP 标签的 cyclinB1 和 Cdk-1 构建体，实现了 cyclinB1 和/或 Cdk-1 在线粒体中的过表达。

通过EdU脉冲追踪实验发现，在表达野生型线粒体cyclinB1-Cdk1的细胞中，标记的S期细胞在4小时内即迅速通过G2/M期并进入G1期；相比之下，转染空载体对照或突变型cyclinB1-Cdk1的细胞则需6小时，表明增强线粒体定位的cyclinB1-Cdk1可加速细胞周期进程。在此基础上，还可进一步采用其他方法检测线粒体ATP生成、耗氧量、膜电位及活性氧水平，以探讨细胞周期激酶Cdk1的线粒体定位如何影响线粒体呼吸功能与能量输出等科学问题。

观看本视频后，您应能充分理解如何研究一种细胞核激酶的线粒体定位及其在线粒体内的特异性功能。