酶联免疫斑点试验（ELISPOT）：针对微生物抗原的Th-1型细胞免疫反应的定量分析

本实验的总体目标是检测T细胞对特定抗原的应答。首先使用捕获抗体进行包被来实现该目标。实验的第二步是加入细胞和目标抗原，然后过夜孵育。

该实验步骤的第三步是加入检测抗体。最后一步是使用底物试剂显色并分析斑点。最终，通过分析斑点形成单位，可以获得所关注的细胞因子结果。

您好，我叫 Dr. Ki Richter，是范德堡大学传染病学部 Wonder Drake 博士实验室的一名研究指导教师。今天我们将演示酶联免疫斑点技术，也称为 ELISPOT 技术。Isfahan Chambers 博士和 Tiffany Cone 将为您演示该技术的操作过程。

为了维持细胞培养标准，需在超净台内无菌条件下进行操作，打开多孔板，用 PBS 洗涤三次。用 PBS 配制捕获抗体的包被溶液。为方便起见，可通过涡旋振荡充分混匀。

将抗体溶液转移至多通道移液器的储液槽中，每孔加入100 µL包被液。用封板膜密封酶标板，并于冰箱中过夜孵育。这些包被抗体的酶标板可稳定保存数周。

经验法则规定，只要孔中仍有液体残留，该孔即可继续使用。为准备本实验，用台盼蓝对新分离的外周血单个核细胞进行活率染色并计数。将外周血单个核细胞以每毫升200万个细胞的密度接种于10 mL培养基中，于37°C、5%二氧化碳条件下孵育过夜。为便于追踪实验进程，请在ELISpot板盖上标记样本编号、孔内条件及日期。

使用无菌 PBS 采用倾倒和吸干法洗涤平板六次。倾倒时注意避免溅出，以免导致平板的孔变为紫色。向每孔中加入 20 媒体，并在 37 摄氏度下孵育平板 1 小时。

在培养板孵育的同时，计数经夜间静置的细胞。通过离心收集外周血单个核细胞（PBMC）。弃去上清液，并将沉淀重悬于10 mL培养基中，调整细胞浓度至每毫升含100万个细胞。

在共培养板孵育一小时后，使用倾倒和吸水纸吸除的方法去除 R 20 培养基。倾倒时注意避免溅出。向每孔加入 100 µL 细胞悬液。

将按照实验设计向相应的检测孔中加入多肽和抗原。务必设置不含多肽的细胞阴性对照孔，以及添加植物血凝素的阳性对照孔。将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。

使用倾倒和吸水法，用150微升1×PBS将平板洗涤六次。向平板的每个孔中加入100微升PBS，并将平板置于冰箱中或室温下15分钟。同时，在PBS中配制生物素化抗体溶液。

从冰箱中取出ALI斑点板，通过轻弹将PBS弃入废液桶中。在向每孔加入生物素抗体溶液时需小心操作，避免溅出。将板置于组织培养罩内，室温孵育1小时。使用倾倒和吸水纸 blot 的方法用PBS洗涤6次，最后一次洗涤时采用该方法。

现在将 PBS 留在平板上。在 PBS 中配制 STREPTAVIDIN 抗体溶液，确保涡旋混匀。弃去各孔中最后一次 PBS 洗涤液，然后绘制 ALI 斑点平板。

向每个孔中加入链霉亲和素抗体溶液，在组织培养罩中室温孵育一小时。为去除多余的链霉亲和素抗体，使用倾倒和吸水纸吸干的方法用 PBS 洗涤六次，在最后一次洗涤时，将 PBS 留在孔板上。注意 B-C-I-P-M-B-T 碱性磷酸酶底物溶液对光敏感。

按照碱性磷酸酶底物试剂盒说明书中的要求，在避光条件下配制底物溶液，弃去各孔中剩余的 PBS，并用吸水纸吸干裂解斑点板。向每孔中加入底物溶液，然后打开光源。显色反应 5 至 10 分钟后，让试剂继续留在板上，直至斑点开始变为紫色且颜色较深为止。

此步骤最多需要 20 分钟。用自来水将 Ali spot 板清洗三次，并静置晾干。每块板包含阳性对照、阴性对照以及待测肽段，每种至少设置两个重复。

阳性对照孔呈现深紫色，表明细胞已形成融合层，且白色背景极少。阴性对照孔无紫色背景，也无任何斑点，符合预期。测试样品孔在此展示了细胞对微生物肽的反应情况。

紫色斑点代表在进行LA斑点技术时表达目标细胞因子的单个反应性细胞。请务必小心，不要用移液器吸头刺破膜，也不要让培养板干燥，因为这会导致背景过高。