从血液中分离、分化和定量人抗体分泌型B细胞：ELISpot作为体液免疫的功能性检测方法

本ELISpot方法的总体目标是实现对血液中人源抗体分泌型B细胞的定量分析。该方法有助于解答生物医学领域中关于B细胞免疫学及疫苗研究的关键问题。该技术的主要优势在于，能够在单细胞水平上检测并测量抗体分泌型B细胞。

本实验操作将由我实验室的研究生 Tsung-Chih Tseng 演示。从肘正中静脉采集10 ml血液样本至含有钾补充EDTA的15 ml离心管后，立即轻轻颠倒混匀数次，以防止凝血形成。随后加入35 ml经高压灭菌的红细胞裂解缓冲液，室温孵育5分钟。

当可通过管壁观察到光线时，离心血液并确认存在白色沉淀。用 10 ml 经高压灭菌的 PBS 去除残留的裂解缓冲液，并将沉淀重悬于 10 ml RPMI 1640 培养基中。将细胞接种至 10 cm 培养皿中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 30 分钟。

然后轻轻旋转混匀培养皿数次，将悬浮细胞转移至一个15 ml的塑料锥形管中。经离心洗涤两次后，用200微升预冷的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，使其浓度为每毫升5至10×10⁶个细胞，并按每1×10⁶个细胞加入5微升生物素标记的针对血细胞的抗人抗体混合物。冰上孵育30分钟后，用10倍体积的无菌PBS洗涤细胞，再将细胞沉淀重悬于每1×10⁶个细胞加入5微升链霉亲和素偶联的磁珠中，继续在冰上孵育30分钟。

孵育结束后，向细胞中加入 2 ml PBS 缓冲液，将离心管置于磁力架上，室温静置 8 分钟。当磁珠吸附至管壁后，小心将上清液转移至新的锥形管中，并向细胞中再加入 2 ml PBS 缓冲液。第二次收集上清液后，通过离心收集合并的细胞，并将细胞重悬于 5 ml 聚苯乙烯管中，用新鲜 PBS 缓冲液调整细胞浓度至每毫升 7 个细胞的十分之一（即每毫升 7×10⁻¹ 个细胞）。

完成非特异性封闭后，将每种筛选抗体各一微克加入至十分之一的六细胞中，轻轻混匀，置于冰上孵育30分钟。在孵育的最后五分钟内，向细胞中加入五微升7-AAD。然后向细胞中加入两毫升新鲜PBS，涡旋混匀后离心。

将沉淀重悬于新鲜分选缓冲液中，浓度为每毫升七次方细胞的十分之一至五倍，然后通过40微米细胞滤网过滤至新的5毫升聚苯乙烯管中。随后，通过流式细胞术将细胞分选至三个含有5毫升新鲜RPMI培养基的15毫升离心管中，以分别收集初始B细胞、记忆B细胞和浆母细胞/浆细胞。当所有细胞收集完毕后，将各细胞亚群以每毫升五次方细胞的十分之一至十倍浓度，接种于12孔细胞培养板的各个独立孔中，培养基为新鲜RPMI培养基。

接下来，在细胞培养孵育箱中，每孔加入5微克CPG ODN 2006，用于激活每毫升含1×10⁶个细胞的B细胞，持续培养5天。激活结束后，每孔加入30微升35%乙醇与蒸馏水混合液，作用30秒。随后将每孔中的乙醇替换为150微升经高压灭菌的双蒸水，室温孵育5分钟，以去除残留乙醇。

用 PBS 洗涤一次，随后向每个孔中加入 50 µL 抗人 IgG 的多克隆 Fab2 片段。用 PBS 将板洗涤两次，方法如前所述。每孔加入 200 µL 含 BSA 的新鲜 PBS，在室温下封闭非特异性结合位点，持续 2 小时。

再次用 PBS 洗涤后，将各孔加入 100 µL 新鲜 RPMI 1640 培养基，在 37°C 下孵育。然后将 ELISpot 各孔中的培养基更换为适量的活化 B 细胞，再用新鲜 RPMI 培养基补至每孔终体积为 150 µL，随后将 ELISpot 板放回细胞培养孵育箱中孵育 8 至 14 小时。

孵育结束后，弃去培养基，用含Tween20的PBS溶液（每孔200 µL）清洗5次，每次3分钟。最后一次洗涤后，向各对应孔中加入适当的检测用一抗，避光孵育2小时。再经过一轮PBS洗涤后，每孔加入50 µL BCIP/NBT底物溶液，在室温下反应5至15分钟。

当出现紫色斑点时，每孔加入100 µL双蒸水终止反应，并用流动的自来水冲洗板子。然后将ELISpot膜避光空气干燥。在此供体PBMC样本中，经红细胞裂解和贴壁细胞去除后，约有10%的淋巴细胞为CD19阳性B细胞。

在B细胞区室中，约50%的细胞为CD27阴性的初始B细胞，另外50%为表达CD27的记忆B细胞。如前所示，对纯化的人B细胞及CD19+CD27+细胞进行CpG处理5天，通常可由1×10⁴个活化的B细胞产生50至200个分泌IgM的抗体分泌细胞以及10至50个分泌IgG的抗体分泌细胞。一旦掌握，若操作得当，该ELISpot技术可在3小时内完成。

在开始此操作之前，重要的是要记住使用适当的捕获试剂对相应位点进行编码，以检测分泌抗体的细胞。该技术建立后，为疫苗学领域的研究人员开展大规模试验和长期随访研究疫苗有效性铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从人血液中纯化B细胞。

分离初始B细胞和记忆B细胞以进行分化，并开展ELISpot实验以定量抗体分泌细胞。请注意，操作人血可能存在生物危害，因此在执行该实验步骤时，务必采取防护措施，例如佩戴手套。