使用Percoll梯度分离脑和脊髓单个核细胞

在感染、创伤、自身免疫或神经退行性疾病过程中，免疫细胞会浸润中枢神经系统。尽管组织化学方法可用于确定浸润细胞的位置并分析相关病理变化，但这些技术受限于可同时使用的抗体数量。本文展示了一种快速分离脑和脊髓组织中单个核细胞的方法，其中所分离的组织首先进行匀浆处理。

接下来，建立 Percoll 梯度，离心后从界面收集单个核细胞。最后，细胞经洗涤后用抗体染色，通过流式细胞术分析，可区分血液来源的细胞与监视型小胶质细胞，并确定其在疾病状态下的相对比例。该技术相较于现有的 Aris 梯度法或组织化学染色等方法的主要优势在于更节省时间。

这使得您能够同时处理更多的组织。梯度设置将由我实验室的技术员 palino A 演示。准备本方案所需的试剂，每只大脑从四毫升储存态等渗 Percoll（称为 SIP）开始。

为此，将九份泊油与一份不含钙和镁的10倍浓度HBSS通过倒置混合均匀。接着，在混合制备的SIP与不含钙和镁的1倍浓度HBSS的同时，配制70%的泊油溶液。然后，将2毫升70%的泊油溶液分装至15毫升聚丙烯圆锥管中，用于收集组织。

进行此操作时，将所有实验小鼠的离体脑组织和脊髓组织置于含有10毫升RPMI的烧杯中，并置于冰上。随后，将组织转移至7毫升或15毫升的下置式匀浆器中，内含3毫升1倍浓度的HBSS，并先使用松配合的研杵轻轻研磨制成细胞悬液，然后更换为紧密配合的B型研杵，进一步解离组织。

组织匀浆后，加入 RPMI 或 1 倍体积的 HBSS，调节终体积至 7 毫升，随后开始制备 Percoll 梯度。首先向细胞悬液中加入 3 毫升 SIP，使 Percoll 的终浓度为 30%。请注意，Percoll 应在室温下使用；若使用低温 Percoll，细胞容易发生聚集，导致细胞分离效率降低。

接下来，使用移液器辅助装置的重力模式，将10毫升细胞悬液缓慢地铺加在70% SIP上层。注意避免混合70%和30%的溶液。这是该操作步骤中最关键的一步。

在70%至30%交界处应可见一条非常清晰的水平线。通常，初次使用该方法的人会遇到困难，因为在分层过程中第三层和70%的溶液容易混合。下一步，将分层后的混合液在18摄氏度下以500 ×g离心30分钟。

确保离心机停止时无或仅有极轻微的刹车，以免扰动界面。离心完成后，管顶应积聚一层浓稠且黏稠的碎片层。其下一层为淡黄色的30% percoll 层，有时含有碎片。

接下来是70至30界面，应可见清晰的白色环状层，其中含有单个核细胞。最后，在试管底部为透明的70%Percoll层。若未观察到界面，则细胞收获量可能极低，导致后续分析极为困难。

因此，此时可能需要使用新鲜的细胞悬液以减少污染。小心移除试管顶部的碎片层并弃去。然后用塑料移液管穿过每份样本上层的30%部分，收集2至3毫升的70/30界面层，并将其转移至含有8毫升1倍浓度HBSS的洁净锥形管中。

将稀释后的界面液轻轻颠倒混匀数次，然后在18摄氏度下以500 ×g离心7分钟。离心后，弃去上清液并重悬沉淀。将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中，加入1毫升细胞染色缓冲液，再洗涤一次。

使用微型离心机在4°C、10,000 ×g 条件下离心1分钟，随后进行抗体染色。为阻断Fc结合位点，将细胞沉淀重悬于50 µL纯化的抗小鼠CD16、CD32抗体中，该抗体用细胞染色缓冲液按1:200比例稀释。与任何染色步骤相同，必须对所有抗体进行充分的滴定，并在冰上孵育10分钟。孵育期间，取出2至5 µL细胞，使用血细胞计数板进行细胞计数。

合并的 naive 脑和脊髓组织每只小鼠应获得约 3 至 5 × 10⁵ 个细胞。炎症脑组织中的炎性细胞数量会因采集时间点及疾病模型的不同而有所差异。在使用 CD16 和 CD32 孵育后，加入 50 µL 免疫细胞特异性抗体混合液。本示例所用的混合液包含针对 CD45、CD4 和 CD19 的抗体，冰上孵育 30 分钟。

重要的是，每种抗体都必须首先进行滴定。为确定最佳稀释度，应根据您所用流式细胞仪的激光器和滤光片配置选择合适的荧光染料组合。细胞染色后，加入一毫升细胞染色缓冲液，以每分钟一转的速度离心一分钟，用细胞染色缓冲液洗涤细胞。

离心后在10,000 G下处理，弃去上清液，然后将沉淀重悬于100至200微升细胞染色缓冲液中，用于立即进行流式细胞术分析或后续分析。将细胞重悬于用PBS配制的2%多聚甲醛中，于4摄氏度保存过夜。图中显示的是获得的单个核细胞，经FC阻断剂孵育后，再与抗CD45、CD4和CD19抗体孵育。

根据流式细胞术所示的实验方案，CD45染色可将CD45高表达的血液来源细胞与CD45弱表达的监视型小胶质细胞清晰分离。该图比较了从健康小鼠和诱导产生实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）后发生炎症的小鼠脑组织中分离出的细胞。Y轴显示CD45-APC荧光强度，在健康小鼠脑组织中可观察到三个不同的细胞群。

仅检测到极少数CD 45高表达细胞，通常少于总分离细胞群体的2%。相比之下，患EAE小鼠的脑组织显示出大量血液细胞浸润并被募集至脑内。

添加其他细胞表面标志物（如 CD11b、CD4、CD8 等）可进一步对 CD45 高表达群体进行表征。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三至四小时内完成。在进行该操作时，需牢记组织学方法与流式细胞术免疫表型分析相结合，对于全面表征中枢神经系统（CNS）炎性浸润细胞的组成至关重要。