从骨骼肌中分离线粒体

本实验的总体目标是分离线粒体并进行线粒体呼吸测定。首先从喷雾dly大鼠中分离骨骼肌，然后将肌肉组织匀浆，并通过离心法分离线粒体。

然后使用Bradford法测定蛋白质浓度。最后，通过多通道生理记录仪测量线粒体呼吸。最终可获得结果显示不同线粒体呼吸状态下的耗氧量。

该方法有助于解答骨骼肌研究领域中的关键问题，例如不同干预措施对线粒体功能的影响。尽管该方法可用于研究骨骼肌代谢，也可应用于其他器官，如肝脏、脑、肾脏或几乎任何组织。在开始实验前，为分离骨骼肌，请准备以下溶液：磷酸盐缓冲液（P-B-S）、含10毫摩尔EDTA的P-B-S、线粒体分离缓冲液一（或IB一）、线粒体分离缓冲液二（或IB二）以及实验缓冲液（或eb）。

请参阅随附的书面实验方案以获取操作说明。接下来，打开离心机并将其温度设置为 4 摄氏度。打开水浴锅并将温度设置为 37 摄氏度。

在一个干净的容器中，将三个 10 毫升烧杯、玻璃匀浆器、玻璃组织研磨器、小型手术剪以及 10 个微量离心管置于冰上。整个实验过程中，所有物品必须始终保持冰上低温。将 IB 1 和 IB 2 置于冰上，EB 则放入温水浴中。

然后将以下溶液加入置于冰上的三个烧杯中：烧杯一，10 毫升 PBS；烧杯二，10 毫升 PBS-EDTA；烧杯三，3 毫升 ib. 一。按照当地机构动物护理与使用委员会批准的程序处死一只大鼠。

接下来用镊子和梅奥剪刀迅速分离250至500毫克骨骼肌组织。在烧杯一中冲洗，然后转移至烧杯二，以匀浆化肌肉组织。首先将其转移至烧杯三，最后用剪刀剪碎。

将溶液转移至Potter-Elvehjem匀浆器中，使用电动研杵在冰上匀浆肌肉组织10次，全程保持离心管处于冰上。接着，将匀浆液转移至预冷的2毫升微量离心管中，在4°C条件下以700 × g离心10分钟。将上清液（S）转移至新的预冷微量离心管中，弃去沉淀物。

在4 °C条件下，将S上清液以10,500 ×g离心10分钟，将上清转移至新的预装微型离心管中，并标记为SN1和肌肉类型Reese。将沉淀重悬于500 µL的IB2中，然后在4 °C条件下以10,500 ×g离心10分钟。将上清转移至新的预装微型离心管中，并标记为SN2和肌肉类型。

将最终的线粒体沉淀重悬于 100 微升 IB 2 中。在微型离心机中短暂离心数秒。若有沉淀，将上清液转移至新的预装微量离心管中，并弃去沉淀。氧电极的校准是本实验方案中的关键步骤，必须每天进行。

在分离线粒体的过程中可完成电极的校准。首先，将 100 毫升蒸馏水加入 250 毫升锥形瓶中，剧烈搅拌 20 分钟。为使水与大气气体达到平衡，用几滴 50% 氯化钾覆盖 GRAT 电极。

接下来，将一小片蓝色Rizla卷烟纸放在电极上方，然后在其上放置一片PTFE膜。

使用环状涂药器安装内环，然后将外环放入电极槽中。连接电极，并组装较大的塑料环形底座、线粒体室和水管。打开 GRAT 箱并启动 GRAS 软件。

将平衡后的水加入线粒体室中。然后加入搅拌子以启动搅拌。单击硬件。

然后以一定速度搅拌。将速度调节至60并点击开始。接下来，启动一项新实验。

单击校准，然后选择液相校准。对于一号箱，将温度更改为37摄氏度，然后单击两次“确定”。当“覆盖”变为“确定”时，单击它并打开氮气罐。

将连接至氮气罐的探针插入腔室，并建立零氧环境。当系统从“覆盖”状态切换后，点击“确定”。吸除水相，向线粒体腔室中加入 500 µL EB 溶液。

用活塞密封腔室。如果使用多个盒子，请对每个盒子从校准步骤开始重复操作。启动新实验并运行约一分钟。

为稳定信号，向每个腔室中加入适量的线粒体悬液，使蛋白含量达到150微克。标记该事件并继续运行。一分钟后，加入10微升预热的250毫摩尔谷氨酸和125毫摩尔苹果酸，使终浓度为5毫摩尔谷氨酸和2.5毫摩尔苹果酸，标记该事件，继续运行一分钟。

此步骤定义为状态二。接下来，加入7.5 µL的10 mM dATP，使其终浓度为150 µM。然后标记并运行30秒。

此定义为状态三。加入另外 7.5 µL 的 10 mmol/L ADP，运行 1.5 分钟。加入 0.5 µL 的冷 10 mmol/L 寡霉素，终浓度为 1 µmol/L，运行 3 分钟。

此定义为状态四。加入一微升冰冷的、0.1毫摩尔的FCCP，使终浓度达到0.2微摩尔标记点，室温下振荡反应三分钟。此定义为状态五。

实验结束后，终止实验并保存数据。使用筏式软件获取呼吸速率，并输入归一化因子。

若加入150微克线粒体蛋白，则归一化因子为0.15。计算不同呼吸状态下的归一化呼吸速率。通过将三态呼吸速率除以四态呼吸速率，计算呼吸控制比（RCR）。

该图展示了骨骼肌线粒体耗氧量的代表性记录。在电极信号稳定后，将线粒体样品加入 GRAT 反应室。状态二呼吸通过添加谷氨酸和苹果酸启动。

加入DP后，氧气消耗增加，定义为状态三呼吸。通过添加寡霉素抑制ATP合酶，从而获得状态四呼吸。

最后，加入FCCP以解偶联线粒体呼吸。该图显示了状态2、3、4和5的代表性耗氧速率。每次实验均计算呼吸控制比（RCR）。

RCR 大于 4 被视为线粒体制备物具有活性的证据。在进行该操作时，必须始终将线粒体样品置于冰上。操作完成后，按此步骤进行后续处理。

还可以进行其他方法，如蛋白质印迹（Western blots），以回答有关线粒体蛋白质含量等其他问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何从骨骼肌中分离线粒体以及如何检测线粒体呼吸功能。