蜱虫中的RNA干扰

本实验的总体目标是通过注射法展示在蜱虫中进行RNA干扰的技术。首先合成目的基因的双链RNA，然后将RNA注射入蜱虫体内，随后将蜱虫置于湿度培养箱中孵育24小时。

经过这一静置期后，将蜱虫置于动物（如绵羊）身上使其最终完成吸血。通过实时荧光定量逆转录 PCR 检测吸血相关参数，包括蜱虫体重、蜕皮情况、卵的发育状态以及目标基因的表达水平。最终，可通过评估蜱虫生物学参数及利用实时荧光定量逆转录 PCR 检测基因表达水平，获得基因沉默对蜱虫生物学功能影响的结果。

我们的研究团队致力于蜱虫相关研究，旨在阐明蜱虫与病原体相互作用界面的分子事件，并利用这些基础信息开发控制蜱虫侵染以及病原体向人类和动物传播的方法。RNA干扰技术已成为该研究领域的重要工具，因为这是目前唯一可用于蜱虫基因操作的方法。许多蜱虫基因的功能尚不清楚。

RNA干扰技术使我们能够定义蜱虫基因及其表达在蜱虫生物学多个方面的功能，包括交配、繁殖、摄食、消化、唾液腺功能以及蜱虫作为病原体传播媒介的能力。本次实验操作将由本实验室的蜱虫RNA干扰团队进行演示，成员包括Ed Lewin博士、研究生Busby以及本人。首先合成含有T7启动子序列的寡核苷酸引物，用于体外转录生成双链RNA。

例如，皮肤中心变异链球菌。使用此处所示的寡核苷酸引物 D eight A a T 75 和 D eight DVT 73。以每种寡核苷酸引物 10 皮摩尔和蜱总 RNA 1 至 10 纳克为模板，通过逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）扩增目标基因。

接下来，纯化PCR产物。然后取8微升或约100纳克产物用于合成双链RNA。为准备蜱虫注射，首先将蜱虫按以下顺序依次洗涤：自来水、3%过氧化氢、蒸馏水两次、70%乙醇，最后用蒸馏水再洗涤两次。

每次洗涤均在50毫升一次性离心管中通过振荡进行，然后将溶液经细网金属筛过滤。将蜱虫在纸巾上静置干燥，根据实验需要，将蜱虫分装为每组20至50只。

将每组放入带紧密贴合盖子的1.25盎司塑料杯中，并用实验组名称标记每个杯子。接下来，组建一个由三人组成的RNAi小组，负责执行注射操作。第一人将每只蜱虫固定在粘附于3英寸×6英寸红色牙科蜡片上的双面胶带上。

第二名人员注射蜱虫，第三名人员在注射后监测蜱虫，向蜱虫呼出二氧化碳以激活它们，并将存活的蜱虫计数后转移至标有实验组编号的杯子中。所有团队成员都必须佩戴一次性手套。开始蜱虫注射操作时，使用杜蒙特精细镊子捕捉一只蜱虫，将其腹面朝上放置在固定于红色牙科蜡片上的双面胶带上，将蜱虫紧密地按每组五只进行分组。用一小条医用胶带覆盖全部五只蜱虫的口器部分。

为了进一步固定蜱虫，应使其大部分身体暴露在外，以便注射者能够观察注射过程。使用装有29号半英寸针头的单孔弹射式胰岛素注射器，在蜱虫外骨骼腹面右下象限刺一个小孔。随后，立即使用自制的哈密尔顿注射器，配合33号一英寸、45度斜面针尖的针头，向蜱虫体内注射0.2至0.5微升的双链RNA溶液。将针头深入蜱虫体腔，以确保双链RNA的准确递送和有效滞留。

尽管注射后会有液体释出，但将注射针头深入放置可确保将足量的双链RNA注入蜱虫体腔，从而引发基因沉默。应注意避免过度注射，以免导致蜱虫体液流失及死亡。注射后应立即用精细镊子从双面胶带上拾起蜱虫，并将其放入塑料恢复容器中。

注射后，蜱虫会短暂地保持不活跃状态，但很快应开始在培养皿中爬行。通过向蜱虫呼出二氧化碳来激活它们。一旦蜱虫开始爬行并恢复活动，注射造成的伤口将迅速愈合，它们极有可能存活下来。

统计每个实验组中的蜱虫数量，并将每组放入带有紧密盖子的标记塑料杯中。在注射下一组实验蜱虫之前，更换当前组中死亡的蜱虫。在注射下一组实验蜱虫之前，用新鲜的3%过氧化氢充满并排出 Hamilton 注射器，以清洁注射器。

重复15次，随后用无菌水洗涤15次。操作时注意不要弯曲Hamilton注射器的推杆，否则推杆将无法顺畅移动，并影响对蜱虫注射时所需轻柔操作的响应。注射完成后，将蜱虫置于一个容器中，容器内盛有水和硫酸钾，以维持高湿度环境，培养一天。

接下来，将单个蜱虫放入粘附在绵羊上的蜱虫饲喂装置中，并让其与等量未注射的雄性或雌性蜱虫共同吸血，选择未被注射的性别。当雌性蜱虫完成约10天的吸血，或对照组雌性蜱虫已自然脱落时，从饲喂装置中收集并轻轻刷下雌性蜱虫。将每组蜱虫置于湿度培养箱中孵育，直至产卵完成。通过称量每组所有蜱虫所产卵块的总质量，按组评估产卵量，以评价蜱虫吸血后的表型变化。

确定存活蜱虫的数量，并计算蜱虫体重、卵的位置以及卵的受精率。根据靶向基因和研究目的，可进行其他分析以通过逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）确认基因沉默效果。饲喂后，分别从对照组注射和双链RNA注射组的蜱虫个体中解剖分离唾液腺和肠道组织，然后从各个组织样本中提取总RNA。

通过实时反转录聚合酶链式反应（real-time R-T-P-C-R）分析各组织中目标基因的转录本，并以蜱源16S核糖体RNA作为内参对RNA水平进行归一化。采用基因归一化（gene norm）方法，在反应结束后运行熔解曲线，以确保仅形成单一扩增产物，且所有样本的扩增产物均在一致的温度范围内发生变性。利用学生t检验（student's T-test）比较对照组注射与双链RNA注射蜱之间mRNA水平的归一化CT值。

本文所述方案已在我们的实验室用于多种外寄生蜱类的RNAi实验。注射到蜱体内的双链RNA量根据蜱的大小而变化。较大的蜱种能够容纳更大的注射体积。

参考文献可在该实验方案的配套书面部分中找到。若操作正确，注射程序在24小时后应导致低于5%的死亡率。此处展示的是在蜱虫中进行基因敲低后的典型表型，其中一组蜱虫被注射了双链RNA混合物，用于筛选蜱源保护性抗原。

在通过光学显微镜检查的蜱虫中，可观察到蜱虫组织中的细胞退化现象。表型变化可能同时伴随功能丧失。例如，SUBIN 基因的 RNA 干扰（RNAi）会导致雄性蜱虫不育，使其无法与雌性蜱虫成功交配。

也可采用其他方法来评估基因沉默对基因和蛋白质表达以及蜱虫生物学的影响，包括实时逆转录聚合酶链式反应（real-time R-T-P-C-R）、光学显微镜、电子显微镜或共聚焦显微镜观察，以及基因组学或蛋白质组学分析。RNA干扰技术也可在蜱虫细胞培养中进行，为研究蜱虫细胞与病原体之间的相互作用提供了一种体外实验方法。