蜱虫肠道内莱姆病病原体快速转移与定位方法

本实验的总体目标是将伯氏疏螺旋体细胞显微注射并定位于蜱虫肠道内。首先制备玻璃毛细管针头，并将其填充伯氏疏螺旋体细胞；随后通过显微注射将伯氏疏螺旋体细胞导入蜱虫肠道中。

随后解剖蜱虫并取出肠道组织。最后，对蜱虫肠道中的 beberg 进行免疫荧光标记。最终可通过共聚焦显微镜观察到 beberg 定位于蜱虫肠道中的 ferry 的结果。

大家好，我是露丝·保罗（Ruth Paul）博士，马里兰大学兽医学院的助理教授。今天，我实验室的两位成员——博士后研究员托罗·开罗（Toro Cairo）和研究生亚当·科尔曼（Adam Coleman）——将向大家演示我们实验室常规进行的通过显微注射对蜱虫进行人工感染的操作流程。显微注射完成后，我们将解剖蜱虫，并利用共聚焦激光扫描显微镜观察蜱虫肠道内的细菌。

蜱微注射技术的主要优势在于能够显著缩短获得自然感染蜱所需的时间。与通过自然吸血过程感染蜱需要约五周时间相比，微注射技术可将整个流程从数周缩短至数小时。该技术还可用于注射其他有用试剂，例如用于RNA干扰的双链RNA，或用于特异性抗体阻断的抗血清。

首先，使用玻璃微电极拉制仪加热并牵拉直径为1毫米的玻璃毛细管，制备多个显微注射针。小心取下这些易碎的毛细管，将针尖朝上放置于培养皿内的粘性胶带上，集中保存。

接下来，将伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi）在BSK培养基中培养。通过在3000 × g条件下离心10分钟，使伯氏疏螺旋体达到约每毫升10⁷个细胞的浓度，形成菌体沉淀。在室温下弃去上清液，并用200微升无菌微孔吸头轻轻吹打，将菌体沉淀完全重悬于BSK培养基中，最终浓度为每毫升10⁹个细胞。

由于细胞在高密度下重悬时可能发生聚集，因此应立即将细胞悬液用于显微注射以制备蜱虫。在玻璃载片上贴上透明双面胶带，并将载片置于防粘垫上操作。使用小刷子小心地将蜱虫从容器中取出，并将所需数量的蜱虫腹面朝上、方向一致地放置在胶带上。用移液器吸取5 µL伯氏疏螺旋体培养物，加载至集束毛细管针中。使用20 µL的微量移液器吸头吸取液体，检查针头内是否有气泡残留，并重新用细菌培养物填充针头。

如有必要，在解剖双目显微镜下观察蜱虫，并聚焦于蜱虫的肛门孔区域。轻轻触碰毛细管针的尖端，使管壁在直径略小于蜱虫肛门孔的位置断裂，从而形成显微注射针。此步骤至关重要，因为使用不合适的针尖对蜱虫进行注射会导致损伤，甚至可能致死。

对已注射的蜱虫，将其置于解剖双目显微镜下固定，并聚焦于肛门开口处，该处由两片可活动的肛板覆盖。使用精细镊子，轻轻触碰并施加极轻微的压力至肛门开口附近的任意区域。

这将使肛门板分离并打开与肠道相连的肛门孔。通过强制分开肛门板，小心地将针尖略微插入肛门开口内。针的插入应尽量轻微，因为玻璃针尖可能会损伤与直肠相连的半透明后肠。

使用配备自动脚控装置的显微注射仪，按照以下参数注射beberg de ferry溶液：1000 Hector Pascals的注射压力，0.2秒的注射时间，以及8 Hector Pascals的补偿压力。每只蜱虫在显微注射后仅接受一次注射。

蜱虫应对刺激表现出活动或爬行，其反应应与注射前相似。为进行免疫荧光显微镜检查而解剖蜱虫时，首先在干净的载玻片上滴加一滴磷酸盐缓冲液用于解剖，另在一张多聚赖氨酸包被的载玻片上也滴加一滴。对于显微镜观察，另准备一张带有双面胶带的载玻片。接着，将蜱虫从容器中取出，并将其放置在双面胶带上。

在解剖显微镜下，使用小刷子将蜱虫固定并聚焦，将锋利的剃须刀片置于蜱虫第一和第二对足之间。用力下压，将蜱虫切成两段，立即用精细镊子将暴露的腹部浸入一滴 PBS 液滴中。用镊子夹住切割部位周围的背侧和腹侧外骨骼。

小心地将背板向上并远离蜱虫体壁拉开，以暴露呈棕褐色的肠道盲囊。在解剖过程中务必始终将蜱虫保持在 PBS 液面下。半透明的唾液腺束位于肠道前部区域的两侧，可根据需要在此时将其移除。

用镊子固定住剩余的外骨骼，小心地将肠道从腹部拉出。仔细清除肠道上附着的任何残留组织，例如气管。用精细镊子的尖端将蜱虫肠道迅速转移至多聚赖氨酸包被的玻片上的一滴 PBS 液滴中。

使用精细刀片或用精细镊子的尖端轻轻按压将肠道分成较小的片段。小心吸除肠道组织周围的过量 PBS。让肠道组织在室温下空气干燥。

将蜱虫肠道浸入丙酮中固定10分钟。室温下自然晾干，此步骤的载玻片可在-20摄氏度的密封容器中保存数月。如需对肠道进行免疫荧光标记，使用Pap笔或其他疏水屏障标记工具在固定的蜱虫肠道周围画一个圆圈。

这有助于在后续孵育步骤中保留染色液。在室温下，用一滴或几滴封闭缓冲液覆盖蜱虫肠道，孵育30分钟。

用于封闭的血清取决于抗体宿主动物的来源。从此时起，切勿让玻片干燥。缓慢吸除封闭缓冲液。

将肠道组织与适当的初级和/或次级抗体溶液共同孵育。我们使用荧光素、异硫氰酸酯或FXI标记的抗B berg抗体。用封闭缓冲液按1:100的比例稀释抗体，孵育一小时。

在室温下，用铝箔覆盖容器以减少光照暴露。通过轻柔吸液去除抗体溶液。使用荧光染料孵育肠道，以标记蜱虫组织，如 DPI 或碘化丙啶。

我们通常在室温下使用含有20微克/毫升碘化丙啶的PBS溶液染色5分钟，然后用含0.05%吐温20的PBS溶液洗涤三次，每次5分钟。最后，将玻片封片于含有抗荧光淬灭剂的缓冲甘油中，并小心加盖盖玻片。此步完成后，玻片可在4摄氏度、密闭容器中保存数月，随后在共聚焦显微镜下进行成像及b berg de ferry的定位分析。

此处展示了一只蜱虫的显微注射过程，注射针内充满考马斯亮蓝以增强可见性。使用精细镊子对蜱虫体施加轻柔压力，使肛板分离并打开肛门孔，以便进行显微注射。图中显示的是肠道盲囊的前部区域，其中含有肠道内的贝伯格费里体（beberg ferry）。

肠道细胞核和螺旋体分别用碘化丙啶或Fitzy偶联的抗贝伯格螺旋体抗体进行标记。掌握该技术后，我们发现可以对10只蜱进行显微注射，通常可有十万只存活并成功感染螺旋体。虽然蜱虫在注射后可立即用于其他实验，但我们通常会等待一到两天，以确保蜱虫在继续实验前能够存活。

观看本视频后，您应充分了解如何利用共聚焦免疫流式技术，通过显微操作将病原体局部注入蜱虫肠道，从而制备人工感染蜱。在操作蜱虫及装有伯氏疏螺旋体等人畜共患病原体的精细玻璃针时，可能存在生物安全风险。请务必注意蜱虫和针头的位置，并始终遵守生物安全二级防护规范。

感谢观看，祝您的实验顺利。