通过整体染色法观察蜱肠道微生物群 原位 杂交

该方法有助于回答蜱虫昆虫学中的关键问题，例如评估蜱虫体内细菌在空间和时间上的存在情况。该技术的主要优势在于无需对蜱虫进行切片，也不需要昂贵的设备，同时能够实现基因转录本在空间和时间上的可视化。通常，初次接触该技术的研究人员会遇到困难，因为该方法涉及多个步骤和多种试剂。

然而，该技术并不繁琐。尽管完成整个过程可能需要大约三天时间，但每天的实际操作时间仅有几个小时。在准备阶段，应在收集蜱虫肠道之前将其喂养 48 至 72 小时。

为了从蜱虫中分离肠道，向干净的玻璃载片上加入 20 至 30 微升 MEMFA 溶液。然后将蜱虫放入 MEMFA 溶液中，并调节焦距至蜱虫头部。接着，使用一对无菌高碳钢剃刀刀片，在盾板处切下头部区域，保留蜱虫体部完整。

接下来，轻轻按压虫体，使肠道盲囊和唾液腺从体壁中排出。然后在不损伤肠道的前提下，小心地将肠道与唾液腺分离，并用刀片小心刮取组织。将所有采集的肠道组织收集至1.5毫升离心管中，加入500 µm的MEMFA固定液。

然后将离心管在室温下轻轻摇动孵育一小时。第二天，按照文本方案中的说明对组织进行脱水处理，并在零下20摄氏度保存。为制备网格篮，首先使用装在手术刀上的加热单刃刀片，将2毫升或5毫升 snap top 离心管的底部切掉。

在完成切割之前，刀片可能需要重新加热数次。接下来，裁剪一块略大于新开口的110微米尼龙网。然后，将网片置于开口处，在中低温度的加热板上轻轻按压导管，使导管与网片粘合，直至形成良好的密封。

冷却后，剪去多余的网片，并确保没有缝隙。制作24个这样的篮子，以匹配24孔板。接下来，在24孔板的盖子上切出孔洞，使样品篮的边缘能够卡住孔洞而不会掉落。

组装完成的样本篮应能完全浸入孔中。现在，可使用此定制的篮子支架，以便在原位杂交过程中相对轻松地将篮子从一个板转移至另一个板。使用两个这样的板，当样本在一个板中孵育时，可同时准备另一个板用于下一步洗涤。

本部分介绍原位杂交的某些步骤。完整操作流程请参见文字版实验方案。首先，将每个固定的组织样本转移至已标记的样本篮中。

根据实验条件对孔板进行排列，每种条件至少染色五只肠道样本。首先，轻柔地重新水化样本。每次洗涤时，通过逐步增加 PBS-T 与乙醇的比例，避免引入气泡。

在第一天，经过两小时的预杂交步骤后，不要丢弃杂交缓冲液，应将其保存起来以备后续实验步骤中使用。之后，在用探针杂交溶液处理样品时，需用铝箔紧密覆盖板子，以防止溶液蒸发。在第二天，将之前保留的杂交缓冲液加入24孔板中，并将板子加热至60摄氏度。

当天晚些时候，为去除探针和杂交缓冲液的所有残留物，先用2x SSC溶液将样品清洗两次，每次清洗三分钟。然后在60摄氏度条件下，用2x SSC溶液将样品清洗三次，每次清洗20分钟。随后在封闭缓冲液中配制一抗。

将500微升该混合物加入每个孔中。封闭步骤后，在室温下孵育约4小时，或在4摄氏度下过夜孵育。第三天，在显色底物中进行显色反应。

用铝箔覆盖样品板。在反应过程中，需定期使用解剖显微镜检查是否染色过度。第四天时，必须在光源箱上进行孵育和漂白，这有助于去除样品中的色素沉着或苦味酸溶液造成的着色，并增强探针信号，以便清晰观察。

然后用 SSC 清洗后，通过将篮子倒置，小心地将肠道样本转移至新的 24 孔板中。样本置于孔中时，用 70% 乙醇彻底冲洗篮子。随后进行样本成像。

在使用RNA探针之前，必须对其质量进行评估。可通过甲醛凝胶电泳检测探针质量。若探针呈现明亮且清晰的条带，则表明其质量良好。

在生物学重复样本以及个体肠道的七对盲囊之间，染色分布存在一定程度的差异是正常现象。因此，每种条件下最好至少染色五条肠道，以了解平均染色模式。总体实验成功与否，最佳判断方法是对比每种条件下正义与反义样本的染色结果。

两者必须在相同的时间内进行孵育。正义样本应呈现极少或无紫色，而反义样本则应显示强阳性染色且背景信号最低。关键的是，组织必须完全浸没在染液中，以确保染色均匀。

避免显色反应过度非常重要。过度显色可能导致背景染色过强，使正义样本开始呈现出反义样本的外观。另一个影响实验结果的因素是蜱虫在实验前的摄食程度。

未进食或仅吸血24小时的蜱虫较难操作，其肠道更容易受损，且不易染色。一旦掌握该技术，若操作得当，可在两到三天半内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要记住，在开始实验之前，应将试剂与材料表中列出的所有用品准备就绪。感谢观看，祝您的实验顺利成功。