高通量 microRNA 表达谱分析：在 Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs 上进行纳升级优化多重 qRT-PCR

本实验的总体目标是通过将多重定量反转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）与微流控平台相结合，以高效、低成本且起始材料需求极少的方式对微小RNA表达进行分析。该流程首先浓缩提取的RNA，随后进行多重反转录和多重预扩增。下一步是纯化去除过量的引物。

最后，利用微流控平台对单重 micro RNA 表达进行分析。该方法可获得在不同目标样本中准确且高度可重复的 micro RNA 表达水平。该技术相较于现有方法的主要优势在于，预扩增后增加的纯化步骤可提高多重 Q-R-T-P-C-R 方法的准确性和可重复性。

从血清中提取的 RNA 开始。使用 RNA 纯化试剂盒或基于苯酚-氯仿法从匀浆组织（如 TRIol）中提取 RNA 时，所有提取步骤之后必须进行洗涤步骤，所有 RNA 样品均需在 -80°C 下保存。浓缩 RNA 溶液。

若起始样本量有限（例如来自血清），请先将 MicroCon 样本储液管插入收集管中，然后用移液器将 RNA 溶液小心加入储液管内，注意移液枪头切勿接触滤膜。随后将收集管和滤器放入离心机中，使裂口带朝向转子方向，离心约三小时。三小时后，RNA 将完全浓缩在滤膜上，以便洗脱 RNA。

向膜中加入适量无RNA酶的水，倒置储液槽并放入新的离心管中。然后在4°C条件下以最大3000 × g离心3分钟。将浓缩后的RNA储存于-80°C，直至使用。对RNA使用xpl反向茎环引物进行逆转录反应，随后进行12至18轮PCR循环后，微小RNA以cDNA链的形式被表示出来。

这被称为PCR前产物。接下来进行定量PCR（QPCR）。需要将PCR前产物与10个碱基对的DNA ladder一同在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行纯化，每条泳道加入5.5 µL的6×橙G染料，并与27.5 µL的PCR前产物混合上样。

以150伏电压电泳55至60分钟。Romo酚蓝在此凝胶中的迁移位置对应于20个碱基对区域。电泳结束后，将凝胶置于避光条件下，在摇床上用Cyber Gold染色25分钟。

从60到80个碱基对的预PCR产物条带处切下凝胶，并将凝胶块转移至已标记的离心管中。如果产物浓度较低，可能无法肉眼观察到条带，但仍存在于凝胶中。现在通过套管离心法压碎凝胶条带，并加入300 µL的TEN缓冲液。

将缓冲液凝胶混合物在37摄氏度下振荡孵育4小时。4小时后，将液体转移至新管中，并加入300微升TEN缓冲液。将此混合物在4摄氏度下振荡过夜孵育。

第二天，再次转移试管中的内容物，并对PCR前产物进行乙醇沉淀。芯片从包装中取出后，必须在24小时内完成预启动，且在预启动后60分钟内完成上样。通过向芯片上的每个蓄液池注入150微升控制线液体，开始对芯片阵列进行预启动。

注意不要将任何液体溅到芯片或入口处，否则芯片将无法使用。然后将芯片放入集成流体电路（IFC）控制器中，并运行控制器的引液程序。程序一经启动，立即开始准备样品。

首先配制预扩增样本混合液，将引物混合液（tack man）、通用预混液（universal master mix）和上样试剂混合。然后按照96孔板上样格式，将每个样本2.25微升与2.75微升预扩增样本混合液混合，以获得上样反应液。短暂涡旋混匀后，在4°C条件下快速离心反应板。

样本板现已准备完毕。接下来使用一个新的96孔板配制13倍浓度的检测混合液。每孔中加入一条通用引物、一条正向引物和一条基因特异性的TaqMan探针进行混合。

通用引物和正向引物的浓度均为1 µM，taqman探针的浓度为0.2 µM。然后加入足够量的Tween，使最终孔体积为5 µL时Tween的终浓度为0.25%。充分混匀以避免产生气泡，并短暂离心以收集液体。

这是检测板。开始进行96.96 Q-R-T-P-C-R实验时，首先将芯片装入。先加入样品，然后加入检测试剂，每孔最终体积为5 µL，加入至IFC中。

其次，运行上样混合脚本，将样品和检测物加载到芯片中。脚本运行结束后，揭开已加载样品的芯片上的保护膜，并使用粘性胶带去除芯片表面的灰尘颗粒或碎屑。现在设置生物系统的扩增程序。

将芯片装入系统并运行程序。使用Fluidigm软件分析结果，可获得扩增曲线、全芯片热图以及每个样本的CT值。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶按大小分离纯化后的PCR前体产物，检测野生型DGCR8和ER缺失突变体。

与先前的实验方案相比，RNA 的制备方法得到了改进。由于增加了纯化步骤，在 DGCR8 缺失和 ER 缺失背景下，能够获得更多的微小 RNA（microRNA），并减少假阳性信号的出现。此外，改进后的定量逆转录 PCR（qRT-PCR）方法有助于对稀有的、DGCR8 非依赖性且 Dicer 依赖性的小 RNA 进行准确分类。

本研究对来自患者和对照组的48份血清样本进行了384种不同微小RNA（microRNA）表达变化的筛查。每个样本的数据通过减去相应的中位数进行标准化处理，且未在对照组中使用外源性内参。观看本视频后，您应能充分理解如何在微流控平台上利用多重定量逆转录聚合酶链式反应（multiplex Q-R-T-P-C-R）技术，即使起始RNA量极少，也能同时对多个样本中的数百种微小RNA进行表达谱分析。