使用定量实时PCR（qPCR）阵列对pre-microRNA和microRNA进行表达谱分析

本实验的总体目标是实现基于QPCR的阵列的快速、可靠自动化设置。首先准备阵列所需的引物组，并配制待检测的样品预混液。随后，使用自动化机器人PCR建库系统或矩阵式电子移液器系统，将样品预混液和引物组精确地分配至384孔板的每个孔中。

制备完成后，使用基于Light Cycler 480的PCR程序运行384孔板的PCR反应。该实验流程的最后一步是分析qPCR数据，并确定每对引物的相对表达水平，每对引物均靶向特定的mRNA。最终可获得结果，显示大量mRNA表达水平的变化。

因此，专门设计的芯片阵列可通过基于QPCR的分析方法，靶向整个前体microRNA谱、特定通路或对病毒感染至关重要的分子。大家好，我是来自北卡罗来纳大学教堂山分校微生物学与免疫学系的Dirk DMA。今天我们将向您展示如何建立实时定量QPCR实验，并介绍两种不同的方法。

一种使用不规则移液器，另一种使用机器人。我们利用该技术检测人类肿瘤中的前体微小RNA和成熟微小RNA。今天的演示将由Pauline Chu和Kristen bu完成。

那么我们开始吧。首先，取出含有186对引物的96孔板，引物以0.5 pM的浓度保存在-20°C条件下，采用96孔板格式。

将板在室温下解冻后，涡旋并短暂离心。同时将Cyber Green 2× PCR混合液在室温下解冻。每块96孔引物板的设置需要四个主混合液管。在四个2毫升离心管中，分别通过混合4微升Cyber Green混合液、3微升PCR级水以及每反应10至20纳克的样品DNA或cDNA来制备主混合液。

每个试管应含有足够进行约100次反应的预混液，以预留移液过程中的损耗。涡旋振荡八联管以充分混匀。使用Freedom Tecan EVO机器人开始前体microRNA检测的设置，首先初始化机器人并加载EVO操作程序。

然后用 30 毫升系统液体冲洗机器人三次，以清除系统中的气泡，避免影响移液准确性。接下来，设置机器人平台，放置一个 384 孔板和一个 96 孔引物板。主混合液置于储液槽中，包含 2% 漂白剂、已加满的系统液体容器和一个空的废液容器。

通过在程序末尾选择“运行”两次来启动自动机器人运行。取出384孔板，并用Light Cycler 4 80封板箔密封，然后对板进行离心。

将密封的384孔板短暂放置于加热模块位置一。随后，使用新的主混合液和新的384孔板，对引物板二重复此过程。将所得的密封384孔板置于加热模块位置二。

打开一个新的 EVO wear 程序，从酒店加载光循环仪并设置循环参数。然后选择运行两次。Freedom Evo 将自动将每块板加载到光循环仪中，并运行一次 Cyber Green HRM 循环程序。

完成后，按照书面实验方案中所述方法对结果进行审查和分析，作为使用机器人的替代方案。可使用矩阵电子多通道移液器，将主混合液管中的溶液逐一分装至储液槽中。

将电子移液器设置为吸取16微升主混合液，分两次每次释放8微升，随后执行吹出步骤。设置完成后，吸取16微升主混合液，并开始将液体加入384孔轮板中。将前8微升主混合液加入第一列的每隔一行中，使用A至O行，下一列保持空置。

将第二个八微升加入第三列的相同行中。然后在废液容器上方排空，并按照隔行隔列留空的模式丢弃吸头。按此方式在整块板上再进行五个循环，以移取第二份主混合液。

使用与第一份主混合液相同的行，但从第二列开始。对第三份和第四份主混合液重复此操作，分别从第一列和第二列开始，但此次使用玫瑰色B至P的引物板布局。将电子移液器设置为吸取2 µL并 dispensing 2 µL，随后执行吹出步骤。

从96孔引物板的第1列A至H行中，吸取2微升引物，转移至384孔板每隔一列的第1列中，在废液容器上方操作并丢弃吸头。针对其余三组主混合液（第1列和第2列）中的每种引物，重复此模式。随后，继续对96孔引物板的第2至第12列进行相同操作，每次对应一种引物列，在384孔板中每隔两列进行转移。

接下来，用荧光定量PCR仪的压板、封口膜密封反应板，并进行离心。离心结束后立即取出反应板，将其放入荧光定量PCR仪（Light Cycler 480）中，使用SYBR Green I HRM检测模式进行扩增循环。

采用与之前相同的循环条件，使用新配制的预混液，将引物板二Eloqua重复此步骤加入新的384孔板中。通过基于新型定量PCR阵列的分析，可获得前体微小RNA的表达特征。以U6为内参计算平均ΔCT值，并将标准化后的数据载入阵列。

Minor软件生成的三个不同聚类以热图形式展示。每个前体microRNA的相对表达水平以红色和蓝色表示，其中红色代表相对表达量上升，蓝色代表相对表达量下降。颜色强度反映表达变化的程度。

大多数前体microRNA的变化较小且无显著性，符合预期。然而，有小部分前体microRNA在整个时间过程中显著增加。此外，某些前体microRNA的相对水平则急剧下降。

在某些情况下，它们在热图分析中也会聚集在一起。根据实验的不同，可能出现依赖于病毒感染、细胞类型特异性表达的微小RNA前体，或受共同分子或信号通路调控的微小RNA前体的聚类。

展示了Posey肉瘤相关疱疹病毒阴性样本在四重重复检测中的平均循环阈值（ct值）。重要的是，通过高灵敏度的QPCR阵列未检测到卡波西肉瘤相关疱疹病毒潜伏相关核抗原（KSHV LANA）。然而，内参对照U6以及高表达的人类前体微小RNA let-7a均在可检测水平表达。

最后，与预期一致，PCR级水的阴性对照未扩增出A-Q-P-C-R产物。对两种不同引物进行的熔解曲线分析，使用相同的样品重复进行，结果如图所示。

显然，两对引物的熔解温度不同，但每个重复样本的熔解温度完全相同。样品质量差或可能被污染的迹象可能包括出现多个熔解峰，提示存在两种不同的模板来源。我们刚刚向您展示了如何使用机器人设置实时定量PCR实验。

务必包含所有对照以及尽可能多的看家基因。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。