关联染色体捕获法用于鉴定远端DNA相互作用

以下实验的总体目标是发现并鉴定远距离相关的DNA配对片段。该目标通过固定细胞、裂解细胞以及利用第一种限制性内切酶消化DNA来实现，随后进行连接反应，形成由两个相关基因片段组成的嵌合DNA。在第二次限制性酶切后，将接头序列添加至嵌合DNA上，以促进其扩增。随后使用接头序列和诱饵DNA特异性引物进行PCR扩增，从而获得足量的相关DNA片段。通过对扩增后的DNA片段进行序列分析，可获得与诱饵DNA存在长距离相互作用的DNA配对结果。

与现有的染色体构象捕获技术（如三C技术）相比，该方法的主要优势在于，A-C-T-S-A 能够有效鉴定未知的远距离关联 DNA 伙伴，而三C技术仅适用于验证先前已怀疑存在的相互作用。开始本实验方案时，将人类细胞在含有5%二氧化碳、37°C的培养箱中培养，直至细胞融合度达到80%至90%。

本实验使用人早幼粒急性白血病细胞。将细胞倒入50毫升无菌离心管中，于1200 RPM条件下离心15分钟以收集细胞。离心后，通过抽吸去除上清液。

加入 5 毫升培养基以重悬细胞沉淀。用血细胞计数板计数细胞后，取约 1 × 10⁷ 个细胞，用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基定容至 40 毫升。然后加入 1.7 毫升 37% 甲醛以固定稀释的染色质。

将样品在室温下轻轻振荡孵育10分钟。孵育结束后，加入2.4毫升2摩尔的甘氨酸终止反应。随后，在4摄氏度、1200转/分钟的条件下离心样品15分钟。

去除上清液后，用40毫升预冷的PBS洗涤沉淀一次，然后离心样品以收集洗涤后的细胞沉淀。将所得沉淀重悬于40毫升预冷的裂解缓冲液中，缓冲液需新鲜添加蛋白酶抑制剂和0.1毫摩尔PMSF，在冷室中旋转孵育90分钟。最后，以2,500 RPM离心15分钟，去除上清液，获得分离的细胞核。将细胞核重悬于0.5毫升1×NEB缓冲液3中，并加入15微升10% SDS。

将样品在 37 摄氏度下振荡孵育 1 小时。然后加入 45 微升 20% Triton X-100 以结合 SDS，并再次在 37 摄氏度下振荡孵育 1 小时，分装为每份 1 × 10⁶ 个。取细胞核（约 15 微克）用于限制性内切酶消化，加入 55 微升细胞核溶液。

加入433 µL NEB缓冲液三和12 µL BglII，使总消化反应体积达到500 µL。将反应体系在37°C下孵育过夜。次日，加入95 µL 10% SDS以灭活限制性内切酶，并在65°C加热20分钟使酶变性。

在水浴中，加入7毫升1×连接缓冲液和360微升20% Triton X-100。将样品在37摄氏度孵育1小时。将温度降至16摄氏度，然后加入50微升400单位/微升的酶。

T四 DNA 连接酶。将连接反应在 16 摄氏度孵育 4 小时，然后在室温下孵育 30 分钟。连接完成后，加入 300 微克蛋白酶 K，并在 65 摄氏度孵育过夜。

然后加入五微克RNAA，在37摄氏度下孵育30分钟。用苯酚-氯仿抽提法纯化DNA，并用异丙醇沉淀DNA，将沉淀的DNA溶解于150微升无菌蒸馏水中。为了向嵌合DNA添加接头，首先通过将两微克纯化的DNA与五个单位的MspI在37摄氏度下孵育四至六小时来消化DNA；消化完成后，在65摄氏度下孵育10分钟以灭活MspI。

然后用乙醇沉淀DNA，并加入一微升浓度为每毫升五毫克的糖原，将所得的DNA沉淀溶解于50微升无菌蒸馏水中。接着，将50微升MSP1处理后的DNA与两微升20微摩尔的连接子寡核苷酸L以及一微升20微摩尔的寡核苷酸S混合，再加入一微升无菌蒸馏水和六微升10×T4 DNA连接酶缓冲液。

用液体石蜡覆盖混合物。在50摄氏度下变性寡核苷酸1分钟，然后以每分钟0.5摄氏度的梯度逐渐冷却至10摄氏度。使用热循环仪，加入1微升浓度为400单位/微升的T4 DNA连接酶，于15摄氏度孵育过夜。

第二天，使用kaya快速PCR纯化试剂盒纯化连接接头的DNA，并用50微升无菌蒸馏水洗脱。然后选择针对要研究长距离相互作用的DNA特定区域的引物。在此示例中，将使用Abel作为引物或诱饵。

将1微升纯化后的DNA与1微升20微摩尔的特异性引物Able One 46 56以及1微升20微摩尔的连接子特异性引物29 63混合，以准备第一轮PCR。然后加入3微升三倍浓度的ClinTech DNA聚合酶预混液（该预混液已按照书面方案与32P-dCTP预先混合），再加入3微升无菌蒸馏水。按照书面方案中描述的热启动PCR热循环程序进行PCR扩增，PCR循环完成后即可。

使用kaya快速PCR纯化试剂盒纯化第一轮PCR产物，用30微升无菌蒸馏水洗脱。取1微升第一轮PCR产物，稀释100倍后用于第二轮PCR，加入1微升20微摩尔的特异性引物abe one specific primer, 46 26，以及1微升20微摩尔的连接子特异性引物29 61。

再次加入 3 µL 的 3 × ClinTech DNA 聚合酶预混液和 3 µL 无菌蒸馏水。使用以下热循环程序进行第二轮 PCR：95 °C 变性 20 秒，67 °C 退火 40 秒，72 °C 延伸 1 分钟，共 25 个循环，最后在 72 °C 延伸 5 分钟。

通过运行5%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在磷屏成像仪中扫描曝光的屏，以观察PCR产物。每条PCR条带均可从凝胶中回收：将凝胶条切下，放入含有60 µL无菌蒸馏水的Eppendorf管中，95 °C孵育5分钟使其溶解，短暂离心，于10,000 RPM离心10秒。

收集所有样品。取一微升作为DNA模板，用于与引物修复进行PCR反应。29 61 46 26。

在相同条件下，经过纯化和测序分析后，可使用在线工具确定其染色体位置。进入基因组生物信息学网站后，点击 BLAT 按钮以打开新窗口，并粘贴DNA序列。提交DNA序列后，BLAT 搜索结果将显示出来。

点击浏览器中与目标序列完全一致（100% 相同性）的匹配结果，以显示该 DNA 序列的位置。将该区域作为诱饵，用于确定其远距离 DNA 相互作用。在第二轮 PCR 引物设计中，选择两个 BGL 两个位点和一个 BAM H 一个位点用于 A CT 检测。引物 46 26 29 61 用于扩增 able M1，46 30 29 61 用于 able M2，46 36 29 61 用于 able M3。

典型的凝胶电泳图谱显示一条至多条条带，此处展示的 able M1、able M2 和 able M3 即为如此。克隆子 able M1 的 DNA 序列表明，A CT 检测中每个片段均由两个连接的 DNA 片段组成：其中一个片段来源于诱饵 DNA 区域，另一个片段则来自与其结合的伴侣序列。

这些片段通过第一种限制性酶识别序列相互连接。第二种酶的识别序列将出现在相应伴侣序列的末端。克隆的ABLE M1片段包含位于9号染色体Q32.4区域的ABLE1基因片段的DNA，其相应的伴侣序列位于3号染色体P3区域，被鉴定为PROC2。

类似地，Able M2 的相关互作伙伴定位于第5号染色体的 Q21.1 区域，而 Able M3 克隆则被鉴定为位于 Able1 位点附近的染色体内互作区域，这与 3C 实验的结果形成对比。本视频中所述的方法将筛选出最普遍的长距离相互作用。然而，通过增加 PCR 循环次数，也有望鉴定出其他出现频率较低的互作。以小鼠成纤维细胞中 IGF2-H19 位点的印记控制区（ICR）作为诱饵 DNA，在 A-CUT 实验中，第一轮和第二轮 PCR 采用了不同的循环程序。

ACT检测还可用于识别正常细胞与癌细胞之间在核结构和长距离相互作用上的差异。将正常结肠组织和结肠癌组织进行匀浆处理，并按照本文所述步骤执行ACT检测。此处展示的是IGF2-H19位点ICR区域以及IGF2基因dpn的DNA结构。

ACT 检测的两个位点以及第二轮 PCR 中使用的引物由不同颜色的箭头和数字标记。ACT 检测的电泳图谱显示了使用引物 29 61 与引物对 41/61、41/63、51/45 和 51/51 进行 PCR 所得到的结果。仅在正常结肠组织中出现的独特条带用黄色箭头标记，仅在结肠癌组织中出现的条带用红色箭头标记。

该技术为市场生物学领域的研究人员探索细胞核结构和基因调控的三维机制铺平了道路。