高通量染色体物理图谱构建的自动化方法 原位 杂交

本实验的总体目标是利用高压染色体制备法，随后进行自动化的荧光原位杂交及自动化成像，将DNA探针定位到蚊子多线染色体上。该目标首先通过高压法制备多线染色体展片来实现。实验的下一步是通过缺口平移法，用荧光染料标记基因组BAC DNA，从而制备荧光探针。

第三步是使用自动玻片染色系统进行荧光原位杂交。最后一步是利用自动荧光成像系统扫描并拍摄标记的染色体。最终，图像可以显示荧光标记的DNA探针在多线染色体上的定位。

该技术相较于现有方法（如标准手动原位杂交实验方案）的主要优势在于，其高通量物理定位方案可产生更一致的结果，并显著减少操作时间。本实验方案首先在雌蚊吸血后约25小时解剖半重力及寡产雌蚊，以收集处于克里斯托弗三阶段的卵巢。在此阶段，滤泡内含有滋养细胞的透明区域应呈圆形。从五只雌蚊中收集卵巢，并将其固定于500 µL新配制的改良卡诺氏液中。

随后可于室温下保存最多24小时，或在-20摄氏度下保存更长时间。接下来，在制备卵巢解剖玻片前，配制Carney溶液和50%丙酸溶液。在解剖显微镜下，将每对卵巢置于无尘载玻片上的一滴新鲜Carney溶液中。

用解剖针将卵巢切开。将所有卵巢组织块转移至六张干净的载玻片上，每张载玻片上含有50%丙酸。使用解剖针将卵泡彼此分离。

然后用纸巾擦去残留的组织。再加入一滴50%丙酸，静置三到五分钟。据记载，将卵泡置于50%丙酸中三至五分钟可显著改善染色体铺展效果。

接下来，盖上盖玻片，再等待一分钟以使细胞核充分展开。用滤纸和塑料膜包裹载玻片。将Dremel转速设定在3,000至5,000 RPM之间，轻轻将旋转的Dremel尖端在盖玻片上旋转约一分钟。

使用相差显微镜确认染色体铺展质量，如有需要，可延长 Dremel 处理时间以进一步压平染色体。将第二块盖玻片紧邻第一块放置，然后用另一块显微镜载玻片将两块盖玻片夹住。接着，用塑料膜和滤纸包裹载玻片，将包裹好的载玻片放入台钳中，施加 85 至 120 英寸·磅的挤压力进行压片。

在将六张载玻片上的染色体压平后，打开载玻片并移除多余的载玻片以进一步压平染色体。将载玻片置于载玻片变性杂交系统中，在55摄氏度下孵育10至15分钟。接着，将一张载玻片浸入液氮中至少15秒，或直至气泡停止产生。

然后用刀片迅速移除盖玻片，并立即将载玻片放入冷的50%乙醇中浸泡5分钟。依次对每张载玻片重复此操作。将载玻片依次在70%、90%和100%乙醇中进行脱水处理。

将它们浸入每种染色缸中各五分钟。最后，待玻片自然风干后，即可用于FISH染色。除探针标记外，其余步骤大多由自动化设备完成。

因此，在加载设备之前，使用商用NIC翻译方案将荧光染料标记到反向DNA上，以制备荧光探针。探针制备完成后，将载玻片和试剂装入自动载玻片染色系统，并对系统进行编程以执行以下步骤：首先，加入800 µL的1×PBS，持续20分钟。

第二，将玻片吹干。第三，用450微升含4%甲醛的1×PBS溶液固定玻片，固定时间为1分钟。然后用100%乙醇洗涤玻片，每次1秒，重复两次，再洗涤2分钟。

乙醇浴处理后，再次吹干载玻片。随后将载玻片在45摄氏度下加热两分钟，以防止产生气泡。接着加入20微升DNA探针，再滴加一滴矿物油，盖上盖玻片，然后将载玻片在90摄氏度下处理10分钟，使染色体变性。

然后将载玻片置于42摄氏度下杂交14小时。杂交完成后，在42摄氏度下进行严格洗脱，持续2分钟，随后连续四次使用2×SSC溶液各冲洗1秒，并干燥。接着在42摄氏度下加入800微升0.4×SSC溶液，每次10分钟，重复两次，之后再进行一次洗涤，并在25摄氏度下用2×SSC溶液洗脱10分钟。

现在加入50 µL的YoYo-1染料，随后加入矿物油和盖玻片。将载玻片在25 °C孵育10分钟。然后移除盖玻片。

将载玻片在2×SSC中清洗四次，每次清洗一秒钟，并将载玻片吹干。最后，向每张载玻片加入15微升ProLong Gold抗荧光淬灭试剂，并加盖新的盖玻片。启动Accord Plus全自动扫描系统，首先打开用于卤素灯泡的Olympus U-R-F-L-T电源。

然后打开计算机，最后打开带相机附件的显微镜。首先启动 duet 软件包，设置一个 10 x 预扫描。单击在线按钮，输入新的病例编号并分配一个玻片编号。

单击标记为 bf 的圆点。这是明场选项。选择扫描选项为 10 × 预扫描。

选择 2,500 x 圆形、10,000 x 圆形或矩形。点击设置并运行。然后，根据提示正确调整扫描参数，再点击完成。

要开始扫描，请按下主选项卡返回主屏幕。然后点击离线按钮，找到已分配的病例编号和玻片编号，并点击离线。

扫描左上角的黑色区域。点击箭头并选择10倍预扫描。找到感兴趣的图像后，使用箭头浏览已扫描的图像。

在目标区域的屏幕中央双击，然后按“抓取”（snap）。在选择所有目标后，系统将针对该区域拍摄图像。右键单击每张图像，点击“分类”（classify），选择“10倍预扫描”（10 x pre-scan），然后选择“polytan”。

返回主菜单并设置 40 倍预扫描。再次选择在线模式并选择一张切片。将明场（BF）更改为 ffl，并将任务名称更改为 revisit dash X 40 dash rg。

将最后一个设置项正下方的部分更改为重新访问 dash all。然后运行程序并按照提示操作。要设置自动化，请单击“开始匹配视图”按钮，以匹配 10 x 和 40 x 的图像。

单击“完成”以开始扫描。完成后，单击“分类”并查看图像。采用高压技术制备了来自冈比亚按蚊雌性突变体的卵巢护细胞多线染色体标本。

该方法不会破坏或改变大部分染色体结构。它能够展平弯曲的染色体，从而揭示在常规制备样本中无法观察到的隐藏细带。染色体使用来自异常 S 品系冈比亚按蚊 Tam back 文库的反向 DNA 克隆进行探针杂交。

该文库由冈比亚按蚊异常S品系的雄性和雌性早期幼虫构建而成。通过此方法，可进行自动化高通量物理图谱绘制，从而促进基于染色体的基因组组装的快速构建。