弹性体 PGS 支架在动脉组织工程中的应用

本视频展示了如何制备多孔管状支架，并将其用于动脉组织工程的动态力学刺激。首先采用可生物降解的弹性体材料及喷射熔融法制备支架，随后对支架进行细胞接种前处理，并将其组装至生物反应器系统中。

在生物反应器中，将血管平滑肌细胞接种于支架上并进行培养。数周后，收获组织并通过扫描电子显微镜、苏木精和伊红染色以及弹性蛋白自发荧光进行分析。所形成的平滑肌组织呈多层结构且排列方向相互垂直。

该技术的主要优势在于类似于颗粒漂白的方法，即利用玻璃模具制备多孔管状支架和透明质酸。作为模具的玻璃管被移除后，支架模具即由一段玻璃管制成。将玻璃管放入支架中，并将前一天配制好的透明质酸溶液倒入管内。

透明质酸溶液沿模具内壁缓慢流下。当溶液到达模具底部时，将模具翻转。重复此步骤，直至模具内壁被溶液均匀覆盖。

包被后，将所有制备好的玻璃模具置于37摄氏度的真空烘箱中干燥24小时。通常在玻璃模具干燥的同时，平行制备四个模具。准备盐颗粒浇注物，将SVE盐颗粒研磨至25至32微米。

第二天，组装准备好的玻璃模具芯轴、PTFE 管、热缩套管和 PTFE 环。首先，将芯轴插入 65 毫米长的 PTFE 管中，并在 120 摄氏度下烘烤 5 分钟。在等待 PTFE 收缩的同时，提前将杂交孵育器预热至 37 摄氏度，至少 30 分钟。

当管路已完全包覆芯轴后，将热缩套管推至芯轴上，使其能够自由移动。然后将芯轴放入玻璃模具内，并将A-P-T-F-E环安装到芯轴底部。检查PTFE环是否紧密贴合在玻璃模具的底部。

接下来，使用刮刀和硅橡胶漏斗，将盐颗粒糊状物加入玻璃模具中。然后用刮刀轻轻敲击模具，使颗粒分布均匀，并刮去多余的盐。现在关闭加热的培养箱，迅速将装有盐的模具放入其中，盐将在接下来的30分钟内融合，之后在37摄氏度的真空烘箱中干燥24小时。

冷却后的第二天，固定住聚四氟乙烯（PTFE）环，将不锈钢芯轴从模具中推出。如有需要，可使用尖嘴钳。然后从模具底部取下聚四氟乙烯（PTFE）环。

接下来，将模具进行烘烤以使套管收缩，并从模具上取下已收缩的套管。让模具冷却至可使用状态，并将其存放在通风橱内的干燥器中。使用滴管，将玻璃模具倾斜45度，同时缓慢旋转模具，将PGS溶液滴入其内腔中。

检查PGS溶液是否沿模具壁流下。如果存在干燥区域，则需添加更多PGS。随后在通风橱中让THF至少挥发30分钟。待THF完全挥发后，将模具置于真空烘箱中固化。

固化一天后，将模具冷却至室温，并缓慢地将其垂直浸入24摄氏度的去离子水中。倾倒过快会产生气泡，导致支架撕裂。小心地将模具转移至水浴中。

使用硅胶管将其倾斜放置，并让透明质酸在1小时内逐渐溶解。若1小时后透明质酸仍未从模具中释放，则保持模具仍处于浸没状态，用刮刀从两端缓慢地将透明质酸推离模具，然后缓慢振荡模具。此时检查支架是否已在玻璃模具内发生移动，若已移动，用镊子缓慢拉动支架，使其从模具中释放出来。

接下来，将制备好的多孔支架小心转移至去离子水浴中，在轻柔搅拌下充分浸提以去除盐粒。该过程至少需要三天时间，并需每日更换去离子水。待盐粒完全浸提后，将每个多孔支架转移至装有去离子水的15毫升离心管中，并置于干冰中冷冻一小时。随后将已冷冻的离心管放入冷冻干燥机中，在管盖打开的状态下冻干三天。

冻干后，将支架存放在干燥器中直至使用。首先将支架切割成25至30毫米的长度。接下来，通过将聚四氟乙烯（PTFE）管穿过每个硅胶塞中间的孔，准备两个硅胶塞。

然后截取一段1.5毫米长的热缩环（hs ring），将其套在支架的一端。将一端连接有橡胶塞的PTFE管推入支架的同一端，确保PTFE管与支架之间有足够重叠并位于热缩环下方，以牢固连接支架与管路。将热缩环放入烘箱中加热收缩，随后让组件冷却至室温。接着，将一根50毫米长的聚碳酸酯管（作为生物反应器腔室）套在支架外部，并固定在硅胶橡胶塞的内表面。

与之前相同，将另一根PTFE管和塞子用hs环固定在支架的另一端，以完成腔室的组装。第二个塞子连接到聚碳酸酯管的另一端。接下来，将两个塞子的外表面分别固定在两块铝合金板上。

将两根带螺纹的金属杆插入每块板侧面的孔中，并用拇指螺钉固定板件。将支架安装到生物反应器上。随后测量每个支架的可见长度（即两个 hs 环之间的距离），并计算其内表面积。

用于细胞接种。在高压灭菌器中，将每个培养室分别用铝箔包裹，并与生物反应器单元的各个部件一同进行灭菌。灭菌完成后，在细胞培养超净台内组装生物反应器。

使用蠕动泵在流动回路中以每分钟一毫米的流速，对支架进行一系列灌注预处理和冲洗。首先依次用70%乙醇、50%乙醇和25%乙醇分别冲洗一小时。完成三次乙醇冲洗后，再用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两小时。

最后，在生物反应器中灌注平滑肌细胞培养基24小时，之后即可进行细胞接种和实验。现在按照随附文稿中的说明，以每平方厘米200万个细胞的密度接种生物反应器，并在接下来的21天内更换管路中的培养基并对泵速进行调整。随着时间推移，构建物内的压力将从培养第一天的约4毫米汞柱逐渐升高，至培养两周后超过100毫米汞柱；培养三周后，收集细胞并按照随附文稿中的要求进行分析前处理。

这些管状PGS支架采用盐融合法制备。扫描电子显微照片显示，所有支架的壁厚均匀，其横截面无局部缺陷。在所有支架的管腔表面均观察到随机分布的大孔和微孔。

细胞培养后，多层平滑肌细胞以垂直于血流方向的取向生长。此外，细胞和脱细胞心肌基质（DCM）蛋白完全覆盖了所有聚癸二酸甘油酯（PGS）支架的管腔内表面。弹性蛋白自发荧光还显示，在支架的管腔表面存在周向排列的弹性纤维。

观看本视频后，您应了解如何制备多孔管状支架，并使用预设计的生物反应器观察细胞及培养支架。