构建双层水凝胶以调控ASC分化

本实验的总体目标是构建一种由天然生物材料制成的复合基质，用于递送并诱导干细胞分化，以促进伤口愈合。该目标首先通过从实验动物中分离脂肪来源的干细胞（a SC）来实现，随后将 a SC 接种至预先制备的壳聚糖微球上。

然后浇铸纤维化胶原凝胶，并将A-S-C-C-S-M微球铺在胶原凝胶上。最后，在A-S-C-C-S-M胶原凝胶上浇铸PEG纤维蛋白凝胶，并加入培养基。最终可获得结果，显示A SC从CSM微球同时向胶原和PEG纤维蛋白基质中进行双向迁移。

通过该操作，单一生源干细胞可接收来自胶原和聚乙二醇纤维蛋白微环境的不同信号，并受到差异性刺激，从而分泌多种效应因子并形成前血管结构网络。该技术相较于现有方法（如单一材料复合物或脱细胞皮肤替代物）的主要优势在于，其他产品无法主动促进宿主对移植物的再血管化。我们最初产生该方法的设想，源于观察到分离的RAD A SE在猪源纤维蛋白基质中培养时，倾向于向血管表型分化。

这一观察结果引发了这样的设想：可同时利用单一干细胞来源，在由不同生物材料组成的系统中进行应用。在分离并培养脂肪来源的干细胞（ASCs）、制备壳聚糖微球（CSMs）并将ASCs载入CSMs后，通过将琥珀酰亚胺基谷氨酸酯修饰的聚乙二醇溶解于4毫升三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（Tris缓冲盐水）中，制备聚乙二醇-纤维蛋白水凝胶。在实验开始前，使用0.22微米滤器对溶液进行除菌处理。

在六孔板的一个孔中，加入500微升纤维蛋白原储备液和250微升PEG储备液，于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育20分钟。接着，将250微升预先制备的A-S-C-C-S-M与pegylated纤维蛋白原溶液混合，立即加入1毫升凝血酶储备液，使用移液器迅速吹打混匀一至两次，立即将细胞凝胶混合物转移至12孔板中，并于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育10分钟。随后，用HBSS洗涤所得的peg纤维蛋白两次，并加入含10%FBS的α最低必需培养基，在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育，于11天内采用标准光学显微镜技术进行观察。

观察细胞从 CSM 迁移至凝胶混合物 A-S-C-C-S-M 的过程，其中 I 型胶原蛋白通过两种正常的氢氧化钠从大鼠尾腱中提取。将 pH 值调节至 6.8 并诱导纤维化。将纤维化的胶原蛋白 A-S-C-C-S-M 混合物加入 12 孔板中，并在 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中孵育 30 分钟。

在确认纤维化完成后，将胶原蛋白 A-S-C-C-S-M 凝胶置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育长达11天。利用标准显微镜技术，在11天内观察细胞从CSM向凝胶内的迁移情况，以构建双层结构，研究单一生源干细胞的迁移性及共诱导特性。使用两种生物支架。

制备胶原蛋白和PEG纤维蛋白凝胶时进行如下微小修改：制备1毫升浓度为7.5毫克/毫升的胶原蛋白溶液，然后将混合物转移至6孔组织培养插入式培养板中，在37°C下孵育30分钟。完全纤维化后，在胶原蛋白表面覆盖200微升含5毫克A-S-C-C-S-M的培养基。

微球在凝胶上沉降后，使用 250 微升细胞培养基制备 PEG 纤维蛋白凝胶。然后将聚乙二醇化纤维蛋白原-凝血酶溶液覆于 A-S-C-C-S-M 胶原层之上。操作完成后，将构建物置于含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中孵育 30 分钟，以实现完全凝固。

最后，在上室的构建物上方加入1毫升培养基，下室加入3毫升培养基。对该支架内嵌入的干细胞（SC）进行表征发现，负载干细胞的CSMs可同时被夹在胶原层与PEG纤维蛋白层之间，并能够差异性地接收来自两种不同细胞外环境的信号，从而在其新条件下良好生长。如图所示，胶原支持ASCs保持干细胞特性，这一点通过其绿色显示的Stro-1表达以及成纤维细胞样的形态得以证实。

相比之下，PEG纤维蛋白可诱导ASCs向无血管表型分化，如本图所示，细胞呈现管状形态并具有管腔，同时特异性表达内皮细胞标志物冯·维勒布兰德因子（von Willebrand factor），此处以红色显示。此外，如本图所示，这些表型在培养早期即已出现，并可持续维持达11天。观看本视频后，您应能够充分理解如何分离大鼠脂肪来源的干细胞，将其接种至壳聚糖微球上，并利用经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的生物材料将其整合至双层水凝胶中。

请注意，本方案中使用的生物材料和细胞来源于动物和人类，如果被宿主的病原体污染，可能具有极高的危险性。因此，在进行这些操作时，必须始终采取适当的预防措施，例如使用个人防护装备和无菌细胞培养技术。