三维光学分辨率光声显微成像

本实验的总体目标是展示体内光学分辨率光声显微成像（optical resolution photoacoustic microscopy，OR-PAM）在无创、免标记条件下对微循环进行观测的方法。该过程首先对实验动物实施麻醉；第二步是通过移动光学分辨率光声显微镜的成像探头，将目标区域定位；随后设定扫描参数并开始图像采集。

最终，通过计算多波长实验数据，获得总氧浓度和血红蛋白氧饱和度的分布。光学分辨率光声显微成像是基于激光激发和超声探测的技术。一束短脉冲激光被聚焦进入生物组织。

光吸收产生瞬态加热，进而引发超声波发射，接收该信号即可形成图像。PAM 的独特优势在于其无接触检测能力以及对光吸收的高度灵敏性。相比之下，现有的反射式光学显微技术主要对光散射或荧光敏感，而 PAM 能够实现活体环境下无需标记、高分辨率的光吸收成像。因此，PAM 已在神经科学、眼科学、血管生物学和皮肤科等领域获得了广泛的生物医学应用。

光学分辨光声显微镜（PAMM）包含光学和超声两个组成部分。光学激发光源为由固态脉冲激光器泵浦的染料激光器。输出的激光束通过中性密度滤光片衰减后，耦合至单模光纤，以实现光传输，从而允许显微镜成像探头进行机械扫描，而非移动活体样本，有效将多模激光束耦合进入单模光纤。

首先通过一个直径为50微米的针孔进行滤波。针孔的位置略偏离聚光镜的焦点，以使其直径与基模光束的直径相匹配。为了形成接近衍射极限的光学聚焦，单模光纤的输出光束被准直后充满显微镜物镜的后光阑。

超声检测采用一个自制的声光束合器，并将其连接至超声换能器。该合束器使光学照射与声学检测同轴对准。在合束器底部研磨出一个球形空腔，以在水中形成数值孔径为0.5的声学透镜，在50兆赫的中心频率下实现43微米的声学聚焦直径。

首次进行对准时，可使用脉冲回波超声来确定声学焦点平面的位置。调整成像探头的垂直位置，直至观察到最强的脉冲回波超声信号。为了最大化检测灵敏度，需对准光学焦点与声学焦点，实现共焦。

将一个光学吸收目标（例如一片黑色电工胶带）放置在声学焦平面上，然后调整光学焦点位置以最大化光声信号。光声显微成像（PAM）系统还包括电子放大器和模数转换器、机械扫描仪以及扫描控制器。

数字化信号被传输至计算机以生成图像。软件将原始数据转换为一系列横截面bcan图像。当显微镜探头对物体进行光栅扫描时，所记录的图像即可显示为单独的横截面图像、二维最大振幅投影图像或三维重建图像。

水箱用于放置显微成像探头。在培养皿上切割出一个成像窗口，并用超声和光学透明的聚乙烯膜进行密封。样品产生的光声波首先通过样品与聚乙烯膜之间的超声耦合凝胶，再通过培养皿中的去离子水，从而实现与超声探测器的声学耦合。

这些现有光学激光器和超声换能器的发明与应用构成了光声显微成像（PAM）系统。在下一环节中，我们将利用该系统对活体小鼠的微血管系统进行成像。如果被成像的动物不是裸鼠，则建议在实验前24小时进行脱毛处理。

因此，皮肤血管的刺激得以恢复。使用医用级氧气气化3%异氟烷对小鼠进行麻醉。典型的流速为每分钟1至1.5升。

根据动物的体重。实验过程中以1%异氟烷维持麻醉，通过夹捏脚趾检查以确保小鼠已完全麻醉。将小鼠转移至装有加热垫的立体定位仪上，以维持其体温在37摄氏度。

现在将耳朵在塑料板上压平，然后在耳朵上覆盖一层超声耦合剂，注意避免在耦合剂内产生气泡。

同时将眼用软膏涂抹于眼睛表面，以防止角膜干燥或意外的激光损伤。避免使用涂抹器直接接触眼睛。然后将耳朵置于成像窗口下方，并缓慢升高动物载物台，直至超声耦合剂接触到膜的底部。

需要轻柔接触，因为将耳朵压在膜上可能会影响耳部的血流。接下来，需对动物采取一些预防措施以监测其生理状态。将脉搏血氧仪夹在小鼠的腿部或尾部。

现在降低成像探头，直到声学透镜浸入去离子水中，并清除声学透镜下方困住的气泡。将激光器设置为外部触发模式，开始试扫描。调节成像探头的Z方向位置，直至光学和声学双焦点位于耳部中央。

现在设置扫描参数并开始正式的图像采集。为了测量总血红蛋白浓度，将波长设置为一个等吸光点（ISO spastic point），在此波长下氧合血红蛋白与脱氧血红蛋白具有相等的摩尔消光系数。

为测量血红蛋白氧饱和度，应将第二波长设置在氧合血红蛋白与脱氧血红蛋白的摩尔消光系数差异显著的位置。操作完成后，清洁小鼠耳朵，并将小鼠放入孵育箱中。环境温度设定为37摄氏度，待小鼠苏醒后，将其自然送回动物房。

该最大振幅投影图像显示了活体裸鼠耳朵的血管解剖结构，成像使用的是570纳米的Pam。此投影图像展示了同一耳朵中血红蛋白的氧饱和度，它是根据在570纳米等吸收波长和561纳米去氧血红蛋白吸收主导波长下获取的图像计算得出的。

对框选区域的进一步观察显示了光学分辨率光声显微成像（ORPM）的成像效果。致密排列的毛细血管床结构被清晰分辨。在本视频中，我们演示了ORPM的典型实验方案，包括系统配置、系统对准、活体实验操作流程以及功能成像方案。

仪器设计与操作中最重要的方面之一是光声共焦对准，这对成像灵敏度和光学分辨率至关重要。光学分辨率光声显微成像结合具有深穿透能力的声学分辨率光声显微成像以及光声计算机断层扫描，有望实现活体内的功能与分子成像，并覆盖从细胞、组织到器官等多个尺度。这种成像可扩展性的起源使其在多尺度系统生物学及转化研究中具有变革性潜力，能够将微观层面的实验室发现转化为宏观层面的临床应用。