无透镜片上断层显微技术结合多角度照明与像素超分辨率

本实验的总体目标是实现对大成像体积内生物样本进行无透镜、基于芯片的三维成像。该目标通过以下步骤实现：首先将样本直接放置在传感器芯片上，并提供部分相干照明；第二步是横向移动光源至不同位置进行记录。

样品的子像素位移全息图像。随后进行子像素位移。在多个照明条件下记录全息图像，用于断层成像。

最后一步是数据处理，其中获取的数据集将被数字重建，最终获得样本的三维断层图像。与传统的光学显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于其紧凑的架构中实现了高通量成像。这使得我们的平台特别适用于与黎巴嫩芯片平台集成。

本报告描述了用于静态样品断层成像的台式系统的基本成像装置。使用配备氙灯的单色仪，调节至在 450 至 650 纳米的中心波长附近输出光谱宽度约为 1 至 10 纳米的光。该部分相干光输出随后耦合至多模光纤，以将部分相干光传输至系统。

光学光纤安装在电动旋转台上，以改变照明角度。带有光源的电动台安装在二维线性XY平台上，用于在给定角度下实现光源在平面内的平移，以便进行检测。采用一个具有五百万像素、像素尺寸为2.2微米的CMOS传感器阵列。

探测器用于记录样本的宽视场全息图像。必须将传感器阵列放置在与光源旋转轴相同的轴向平面上，以确保检查传感器在大角度照明下是否接收到足够的光。尽管无透镜光学断层成像技术可对多种物体（如细胞和微生物）进行成像，但本文通过使用手术刀或刮勺对海兔卵样本进行三维显微成像，来演示其基本原理。

从含有接种器官培养物的培养皿中取一小块琼脂。每边几毫米的立方体琼脂块将包含数百条线虫。将一小块琼脂放入含有1毫升去离子水的聚丙烯小瓶中。

轻轻涡旋30秒至1分钟。10到15分钟后，线虫应从琼脂中爬出进入去离子水中。注意，此处线虫体型过小而无法看见，以暂时固定线虫，加入一毫升5至10毫摩尔的Lima。

将溶液静置10分钟。用移液器从离心管底部吸取5至10微升样品，夹在两张盖玻片之间。此样品中含有大量暂时固定的线虫，可置于检测器上以开始数据采集。

为便于说明，本节总结了典型的无透镜光学断层扫描（LOT）实验的图像采集步骤。然而，整个过程已通过定制开发的 LabVIEW 界面实现自动化。若需手动操作，首先将旋转台的初始角度调整至负 50 度，其中 0 度对应光源的垂直位置。接着将 XY 平台的初始位置调整至 0,0，即归零位置。

调整探测器的曝光时间，以最大限度地利用其动态范围，使图像在不改变旋转台角度的情况下尽可能明亮，且无任何像素饱和。每幅图像采集九张图片。移动XY载物台，在一个3×3的方形网格中到达新位置，使每幅图像相对于前一幅图像移动约四分之一个像素。

在每个角度采集更多图像可能会提高分辨率，具体效果取决于物体类型和信噪比。在初始角度采集完九幅图像后，将 XY 载物台的位置调回零零位置。随后以两度为增量逐步增加旋转台的角度，直至达到正 50 度。

每次在新角度增加后，重复上述步骤。角度增量可根据采集时间与成像分辨率之间的优化需求设置得更精细或更粗糙。数据采集完成后，将获得一组共459幅图像，其中包含在51个不同照明角度下、每个角度对应的9幅子像素位移图像。

每组九幅图像通过像素超分辨率算法进行数字处理，以获得一幅高分辨率投影图像。随后，对每个角度的全息图像素超分辨率结果进行数字重建，以获得51幅投影图像。此处展示的数据处理使用笔记本电脑完成。

使用图形处理单元，全视场的重建将耗时不到一秒。这组51个投影图像随后使用Tom OJA插件进行反投影。对于Image J，首先将投影图像加载到Image J中，然后调用Tom OJ插件。

将提供每幅投影图像对应观测角度的查找表加载至OJ。利用加权反投影方法，可获得样品的三维断层图像。此处展示了无透镜光学断层成像的大视场特性，样品被直接放置在探测器阵列上方。物体的全息图像可在24平方毫米的视场范围内被记录，若采用具有更大有效面积的新型探测器阵列，该视场还可进一步扩大。

尽管探测器阵列的像素尺寸限制了记录的全息图像的分辨率，但像素超分辨率技术可以缓解这一问题。此处展示的是经过像素超分辨率处理的全息图，以及重建后的投影图像，这些投影图像在三种不同的照明角度下实现了亚微米级的空间分辨率。可通过断层成像图像重建技术将这些投影图像进行组合，以计算出样品的三维断层图像。此处展示了通过蠕虫前部在XY平面上的三个切片图像，其中咽管结构仅在Z等于8微米的切片中可见，这与该近似圆柱形结构（外径约5微米）的预期相符。

此外，XZ 平面的横截面图像清晰地显示了线虫的边界以及内部咽管的结构，表明咽部的三维成像已成功实现。随着该技术的发展，研究人员将能够对数十毫米成像体积的管状样本进行三维显微观察。因此，无透镜光学断层扫描技术可成为黎巴嫩芯片平台中高通量成像应用的有力工具。