高效转染树突状细胞且不诱导细胞成熟的优化方案

本实验的总体目标是通过siRNA转染在DCS细胞中敲低目的基因的表达。首先需要对AM Maxin Nucleo效应器进行编程。实验的第二步是将DCS细胞与siRNA混合，并将所得的细胞溶液用移液器加入Nucleo QVE模块中。

该实验步骤的第三步是将培养板放入Amaxa Shuttle样品槽中，以启动转染过程。实验步骤的最后一步是用病毒侵染细胞，以激活干扰素反应。最终可通过定量RT-PCR和蛋白质印迹法获得显示基因敲低的结果。

该技术对于表征树突状细胞中的信号通路具有重要价值，并可能促进基于树突状细胞的免疫治疗的发展。为了对 Maxon 96 孔穿梭核因子转染仪进行编程以用于树突状细胞转染，请先打开一个新的参数文件。通过在 96 孔板示意图上拖动光标，选择您将用于标准转染的孔数。

每个实验样本至少使用三个孔进行合并。现在在第一部分输入程序代码，选择 F、F，在第二部分从下拉菜单中选择 1 68。然后在溶液框中选择 monocyte human，接下来在对照选项下选择 standard，然后点击 apply。

为了设置无转染对照，需要从图示中选择额外的孔。然后在对照选项中选择无程序对照，并再次点击应用。混合核转染溶液后，将其静置至室温。

按照图示方向，将所需数量的nucleo vete模块正确插入nucleo VETE板中，先将第一个模块插入1号和2号玫瑰色孔，然后依次插入后续所有试管。从细胞培养瓶中转移足够量的DCS至50毫升离心管中，使每孔含有500,000个细胞，将细胞在4°C条件下以400 ×g离心10分钟，然后小心去除上清液。接着，向离心管中加入核转染溶液，通过轻轻吹打数次重悬DCS细胞。

现在根据将要进行的特定处理标记EP管，并将重悬的细胞分装至已标记的EP管中。向相应的EP管中加入终浓度为每500,000个细胞0.25微克的siRNA，然后用移液器吹打混匀细胞悬液。对于无转染对照样品，使用非靶向siRNA。

然后根据预先设定的实验布局，用移液器将20微升SI RA DC细胞悬液加入核转染模块中，确保液体被输送至孔的底部。用盖子盖住核转染板，并在硬质表面上轻敲数次，以促进气泡排出，从而完成对树突状细胞（DCs）的转染。将准备好的核转染板插入核转染效应96孔穿梭托盘中。然后点击上传并启动按钮。

在显示屏上跟踪转染过程的进展。绿色背景上的黑色十字表示该孔中的转染成功，而红色背景上的黑色横条表示转染过程中细胞转染失败。转染过程完成后，预热树突状细胞（DC）生长培养基，取出培养板，向每孔中加入80 µL预热的DC生长培养基。

使用多通道移液器，将培养板在37摄氏度、5% CO2条件下孵育10分钟。孵育期间，按照与核小板设置相同的方向，向基质管中加入100微升预热的DC生长培养基。孵育结束后，将细胞悬液从核小杯中全部100微升转移至预先准备好的基质管中。

然后移除并丢弃未发生转染的试管。最后，将基质管在24小时或其他所需时间间隔内进行孵育。为每根正在孵育的基质管标记相应的eInor管。

然后将基质管从培养箱转移至细胞培养操作台，将每个实验样本的基质管合并至预先标记的 eend dfs 中。接着，在台式离心机中以 400 ×g 离心 10 分钟，轻柔地沉淀细胞。离心后弃去上清液，用含有新城病病毒（Newcastle disease virus，NDV）且感染复数（MOI）为 1 的无血清培养基轻轻重悬细胞。

以无菌操作方式覆盖表皮内啡肽，然后将试管孵育45分钟。孵育结束后，加入900 µL DC生长培养基，并将试管再次孵育8至10小时。收集转染并感染的树突状细胞。

通过台式离心机离心离心管，使细胞沉淀，操作同前，并移除上清液。单核细胞分别转染靶向RIG-I的siRNA或非特异性对照siRNA，并按加号所示感染新城疫病毒（NDV），或按减号所示保持未感染状态。通过定量RT-PCR检测，发现RIG-I在转录水平的表达被敲低了75%。同时观察到干扰素β的表达也出现类似程度的下降。作为RIG-I在干扰素信号通路中的下游效应分子，其表达亦被显著抑制。此外，在未感染的对照转染细胞中，干扰素β的表达未被检测到。

而MXA和干扰素β下游应答基因的表达则极低。本实验展示了在树突状细胞中使用靶向RIG-I的siRNA进行第二次转染的数据，实验操作同前一图所示。然而，所有细胞均感染了新城疫病毒（NDV），并额外增设了一组未剪切单核细胞来源的树突状细胞作为对照。

基因沉默结果与前一张图中观察到的结果相似。使用RGA探针进行的蛋白质印迹结果显示，该基因的蛋白表达已完全被阻断。第一道和第二道显示的是未切除细胞裂解液的数据。

第三和第四泳道显示转染了 glow irna 的细胞裂解液，第五和第六泳道显示转染了靶向 RIG I 的 S Irna 的细胞裂解液。一旦掌握，该技术可在一小时内完成，包括同时敲低多个基因。