一种高效且高得率的小鼠树突状细胞亚群分离方法

本方案的总体目标是建立一种高效、高产量的方法，用于生成能够真实反映其体内表型和功能差异的树突状细胞（DCs）。树突状细胞在淋巴器官中以大量群体存在。因此，我们使用滤膜配体来提高供体组织中这些关键细胞的频率，以促进其分离。

该技术的主要优势在于，仅使用市售试剂即可获得足够数量的各种DC亚群，用于后续分析。要收获表达flt-3配体的B16黑色素瘤细胞（来自90%融合度的培养物），首先用PBS洗涤细胞，然后在37摄氏度条件下用0.5%胰蛋白酶孵育培养物。5分钟后，加入20毫升4摄氏度的完全DMEM培养基以终止蛋白酶活性，并通过轻敲和轻柔吹打使贴壁的细胞单层脱落。

通过离心收集细胞并进行计数。然后，将单细胞悬液用 PBS 重悬，调整浓度至每毫升含 1 × 10⁸ 个细胞，用于皮下注射至 C57BL/6 受体小鼠。当肿瘤直径达到 2 至 10 毫米时，取荷瘤动物的脾脏，并将其置于含有新鲜 RPMI 培养基的培养皿中。

使用手术刀将组织切成 0.2 平方厘米大小的片段，然后将组织碎片置于含有胶原酶和 DNA 酶的 10 毫升溶液中，在 37 摄氏度条件下孵育。30 分钟后，将部分消化的组织悬液倒入 70 微米细胞滤筛中，并用 5 毫升注射器的推杆将剩余的组织碎片压过滤网。用 10 毫升新鲜培养基冲洗滤膜，将冲洗液与单细胞悬液合并，随后离心收集细胞沉淀。

将细胞沉淀在室温下用2毫升红细胞裂解缓冲液重悬10分钟。随后用10毫升新鲜RPMI培养基洗涤细胞，并将其重新悬浮于细胞分选缓冲液（含FC阻断剂）中，浓度为每毫升1×10⁸个细胞。为分离浆细胞样树突状细胞（pDC），取300微升来自浆细胞样树突状细胞分离试剂盒的生物素标记抗体混合物，与200微升脾脏单细胞悬液充分混匀。

将细胞置于冰水浴中15分钟，每3分钟轻轻敲击一次。然后用12毫升细胞分选缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于500微升新鲜分选缓冲液中。接着，将细胞与300微升抗生物素抗体偶联磁珠在冰水浴中孵育15分钟，期间定期轻敲。

用新鲜分选缓冲液洗涤细胞后，将沉淀重悬于 2 毫升细胞分选缓冲液中，并将合适尺寸的磁性柱安装至对应的磁铁上。用 5 毫升新鲜的 4 摄氏度细胞分选缓冲液平衡磁性柱。当缓冲液完全从柱顶部流尽后，小心地将细胞加至柱头表面的中心位置，并收集穿流组分。

然后用10毫升新鲜的、4摄氏度的分选缓冲液洗涤柱子，并将流出液收集到同一管中。经过第二个磁性柱后，可获得纯度高于94%的血浆样树突状细胞群体。为了分离CD8α+和CD8α−树突状细胞，将剩余的脾细胞悬液与CD8α+树突状细胞分离试剂盒中的100微升生物素标记抗体混合液在冰上轻轻混匀15分钟，期间轻弹管壁，操作方法如前所示。

孵育结束后，用12毫升4摄氏度的细胞分选缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于150微升新鲜的4摄氏度细胞分选缓冲液中。接着，将细胞与100微升CD8α+树突状细胞分离试剂盒中的抗生物素珠混合。冰上轻柔震荡孵育15分钟后，用10毫升4摄氏度的细胞分选缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于1毫升新鲜的4摄氏度分选缓冲液中。

孵育结束后，通过磁珠分离法对细胞进行分选（方法如前所述），收集流穿液和第一次洗涤液。随后，离心沉淀细胞，并将细胞沉淀重悬于1毫升新鲜的4摄氏度细胞分选缓冲液中。接着，向细胞中加入试剂盒提供的200微升抗CD8α偶联磁珠进行标记，然后将细胞通过新的分选柱，收集CD8α-树突状细胞的流穿液。

为收集CD8alpha+树突状细胞，将柱子转移至一个15毫升锥形管中，并用5毫升新鲜的4摄氏度细胞分选缓冲液冲洗柱子。在使细胞通过第二个柱子后，可获得纯度超过96%的CD8alpha+树突状细胞群体。为分离CD8alpha-细胞，离心CD8alpha-穿流细胞悬液。

然后用100微升抗CD11c磁珠标记细胞，并如前所述收集磁珠阳性细胞群体，以获得纯度超过97%的CD8α树突状细胞亚群。最后通过台盼蓝排斥法测定活细胞数量。一旦肿瘤变得可触及，携带B16 flt-3配体肿瘤的小鼠脾细胞数量会持续显著增加，这与脾脏树突状细胞亚群的扩增密切相关。

有趣的是，尽管在这些动物中传统树突状细胞的绝对细胞数量增加了15至20倍，但浆细胞样树突状细胞亚群仅增加了约4倍。不同树突状细胞亚群根据其B220、CD11b、CD11c和CD8alpha的表达情况进行鉴定。这些细胞群体还表现出其他独特的亚群标志物，其中mPDCA1仅在浆细胞样树突状细胞上表达，DEC205在CD8alpha+树突状细胞上高表达，而CD11b和33D1则在CD8alpha-树突状细胞上最为显著。

利用该方法，我们已证明CD8α+ DC在通过CD结合分子向一种称为不变的NKT细胞的特殊T细胞群呈递抗原方面效率最高。DC分离最关键的步骤是保持严格的无菌和无抗氧化剂环境。在操作过程中，这些T细胞对抗氧化剂高度敏感。

在进行该实验操作时，重要的是要记住轻柔地处理细胞，因为反复的机械刺激可能会改变树突状细胞的成熟状态。一旦掌握，该技术可用于从单个脾脏中分离出大量所有主要的树突状细胞亚群。感谢观看，祝您的实验顺利成功。