基于HLA-Ig的人工抗原呈递细胞用于高效 离体 人类CTL的扩增
2011年4月11日
介绍了一种新的无需树突状细胞的抗原特异性T细胞诱导与扩增方法。基于HLA A2-Ig的人工抗原呈递细胞（aAPC）可加载HLA-A2限制性多肽，从而高效扩增具有不同抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。该技术在基于CTL的过继性免疫治疗中具有广阔的应用前景。
本实验的总体目标是利用人工抗原呈递细胞（aAPC）在体外扩增人源抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），以期用于过继性免疫治疗。该过程首先将HLA-A2-Ig及抗人CD28单克隆抗体共价偶联至磁性Dyna珠，制备aAPC；第二步为对aAPC进行质量控制并加载抗原肽；第三步是从人外周血中分离CD8阳性T细胞；最后一步是将CD8阳性T细胞与aAPC共同孵育一周。
随后收获CTL并进行表征，然后将其直接使用，或再刺激一周，以达到所需的特异性和扩增水平。最终可获得四聚体或染色结果，显示在A APC存在下扩增的CTL具有更高的抗原特异性。今天，我将向您展示一种基于HI IG的A APC系统，以及如何利用该系统在体外高效扩增CMV特异性人CTL，并与其他现有方法进行比较。
我们的 A A PC 技术具有多项重要优势：它可直接购买获得，数量不受限制，且可用于所有 HRAA 2 阳性供者。现在开始操作：将一毫升 M four 50 环氧珠从储备液（约四亿个珠子）转移至无菌螺口玻璃管中。
加入一毫升 boid 缓冲液洗涤磁珠一次，然后将玻璃小瓶紧贴 dyin all magnet NBC one，使磁珠吸附在小瓶管壁上。通过抽吸去除上清液。将磁珠重悬于 boid 缓冲液、HLA A2 Ig 二聚体和抗人 CD28 单克隆抗体的混合液中。
然后，为促进蛋白质与磁珠的偶联，在4°C条件下将玻璃小瓶置于旋转仪上旋转24小时。接下来，将离心管放入MPC1磁铁中，彻底去除所有硼酸盐缓冲液。缓冲液去除后，用1毫升磁珠洗涤缓冲液将磁珠洗涤两次。
现在将珠子在1 mL珠子洗涤缓冲液中孵育，并在4°C下旋转小瓶24小时，以封闭珠子上残留的蛋白质结合位点。然后从玻璃小瓶中移除缓冲液，并替换为1 mL新鲜的珠子洗涤缓冲液。将100 µL Fax洗涤缓冲液转移至Fax管中，然后加入5 × 10⁵个珠子。
将珠子与一微升抗小鼠IgG、一微升PE标记的抗小鼠IgG二抗在4°C下避光孵育20分钟。每个染色样本中加入三毫升FACS洗涤缓冲液。然后在4°C下以300 × g离心五分钟，沉淀AA PC。
将A A PC重悬于新鲜的fax缓冲液中，并立即通过流式细胞仪读取染色结果。用无菌PBS按前述方法将磁珠洗涤两次。接着，向磁珠中加入10 µL CMV肽进行负载。
使用血细胞计数器对珠子进行计数，然后标注珠子的日期和浓度，单位为每毫升珠子数。将AAPC与多肽在4摄氏度下孵育至少三天。从HLA-A*02阳性供体采集约100毫升新鲜外周血，置于含10单位钠肝素的真空采血管中，以300 × g离心10分钟。
在室温下，小心吸取上层血浆层。用无菌 PBS 替代收集的血浆，并将血液转移至无菌的 T75 培养瓶中。当所有血液收集完毕（共 15 毫升采血管加上 4 个 50 毫升锥形管）后，通过移液充分混匀血液与 PBS。
将30至35毫升的血细胞缓慢叠加到每根试管中分离液的上方。保持分离液与血细胞之间的界面清晰，将血液与分离液梯度在室温下以500 ×g离心20分钟，关闭刹车并尽可能调低加速度，以维持离心后各层之间清晰的界面。离心后，吸除上层血浆层，然后使用血清学移液管小心吸取PBMC层。将所有收集的PBMC转移至一个新的50毫升锥形管中，加入30毫升PBS重悬细胞，随后进行离心。
接下来，弃去上清液并洗涤沉淀。再用 30 毫升 PBS 洗涤一次，以去除残留的纤维蛋白，然后使用 Miltenyi 人 CD8 阳性 T 细胞分离试剂盒，按照制造商的说明书富集 CD8 阳性 T 细胞群体。通过流式分析计数 CD8 阳性 T 细胞并确认其纯度。
将100万个CTL悬浮于8毫升含T细胞生长因子2×的培养基和8毫升完全RPMI培养基中，并加入1×10⁶个A APC混合物。然后使用多通道移液器将每孔160微升细胞悬液接种至96孔U型底组织培养板中。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下孵育7天。
第4天，每孔加入80 µL T细胞生长因子2×培养基，对细胞进行换液。第7天收集细胞，然后将细胞置于磁铁上，当所有磁珠吸附至离心管管壁时，去除旧的AA PC。
收获细胞并转移至另一个50毫升锥形管中，计数细胞数量。根据制造商说明书，通过四聚体染色法确定抗原提呈细胞（A A PC）的抗原特异性。在相同条件下，将收获的细胞与新的抗原提呈细胞（A A PC）共同培养，以扩增具有抗原特异性的细胞数量。
以下是一例经 A A PC 培养一周后生成的针对巨细胞病毒（CMV）特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的四聚体染色结果。图中同时展示了一例相应的细胞内细胞因子染色结果。通过四聚体染色检测，CMV 特异性 CTL 的比例为 61%。该方法可用于解答T细胞研究领域中的关键问题，例如：如何确定T细胞功能调控所需的最优培养条件及其相关要求。
这一简单方法为治疗病毒性疾病提供了见解，也可应用于癌症等其他领域。
概述
本文介绍了一种利用基于HLA A2-Ig的人工抗原呈递细胞（aAPC）诱导和扩增抗原特异性T细胞的新方法。该技术旨在提高细胞毒性T淋巴细胞（CTL）扩增的效率，从而为过继性免疫治疗的潜在应用提供支持。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 治疗学
背景
- 过继性免疫治疗利用T细胞靶向特异性抗原。
- 传统的T细胞扩增方法在效率上可能存在局限。
- 人工抗原呈递细胞（aAPC）可增强T细胞的活化与扩增。
- 基于HLA A2-Ig的aAPC可负载特异性肽段，用于靶向性CTL扩增。
研究目的
- 建立一种高效体外扩增人抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的方法。
- 展示使用基于HLA A2-Ig的人工抗原提呈细胞（aAPC）相较于现有方法的优势。
- 评估扩增后CTL的抗原特异性。
使用的方法
- 将HLA A2-Ig和抗人CD28单克隆抗体偶联至磁珠。
- aAPC的质量控制及肽段负载。
- 人外周血CD8+ T细胞的分离。
- 用aAPC与T细胞共孵育以实现扩增和表征。
主要结果
- 扩增的CTL表现出增强的抗原特异性，这通过四聚体染色得以证实。
- 该方法可实现aAPC的即用型供应和无限量生产。
- 使用所述的aAPC系统可高效扩增CMV特异性CTL。
- 对CTL的表征证实了其功能性和特异性。
结论
- 基于HLA A2-Ig的aAPC系统是用于CTL免疫治疗的一种有前景的工具。
- 该方法为生成抗原特异性T细胞提供了一种可扩展的技术途径。
- 未来的研究有望进一步提升该技术在临床环境中的应用。
常见问题
执行层面的行业相关性
抗原特异性CTL的高效体外扩增是传染病和癌症过继免疫治疗开发中的关键瓶颈。基于HLA-Ig的人工抗原提呈细胞（aAPC）平台能够规模化、可重复地生成高特异性CTL，克服了自体树突状细胞方法的局限性。该技术通过提供标准化、即用型的强效T细胞制备方案，支持产品管线的推进。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在受控的体外系统中探究CTL激活通路及其抗原特异性。
- 通过扩增具有明确肽段特异性的CTL，支持免疫靶点的功能验证。
- 可直接评估CTL效应功能和表型，有助于进行作用机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 为下游实验提供可重复的平台，用于生成经过验证的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）群体。
- 标准化扩增条件，提高实验间的可比性以及定量结果的可靠性。
- 实现CTL的可扩展化生产，适用于化合物筛选或免疫调节研究。
转化与临床前研究
- 通过生成效应记忆性CTL，与转化生物标志物研究策略相一致，可用于功能研究。
- 通过实现重复、高保真度的CTL扩增，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 通过提供稳定且抗原特异性的T细胞群体，降低临床前模型中的生物学风险。
流程与工作流整合
这种基于aAPC的方法可整合到免疫治疗流程中，从早期发现到临床前验证，实现对CTL的迭代假设检验和功能评估。
- 发现生物学：支持抗原特异性CTL应答及通路调控的假设驱动型评估。
- 筛选：提供标准化、可重复的CTL细胞群，用于检测开发和化合物评价。
- 分析：提供四聚体染色和细胞因子谱型等定量读数，用于不同条件间的比较。
- 转化研究：有助于与疾病相关的免疫生物标志物及临床前模型需求相衔接。
- 企业级复用：提供即用型、可扩展的平台，可适应多种抗原和研究项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）功能及其靶点验证特异性的预测可信度。
- 操作价值：增强CTL扩增工作流程的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：提升免疫治疗项目中“推进/终止”决策的质量，降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：实现基于风险调整的CTL治疗候选物的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备免疫学、细胞培养和流式细胞术方面的专业知识，以进行质量控制和表征分析。
- 需要具备磁珠偶联、多肽合成以及分析仪器的使用条件。
- 要求不同团队之间在扩增方案和分析终点上实现标准化。
- 可适用于多种抗原，但仅限于如文中所述的HLA匹配的供体系统。
- 依赖于每种应用中经过验证的多肽负载和功能性CTL评估。
