开发一种抗原驱动的结肠炎模型以研究抗原呈递细胞向T细胞呈递抗原的过程

该抗原驱动型结肠炎模型的总体目标是确定在抗原特异性结肠炎过程中，CX3CR1阳性的单核吞噬细胞是否与CD4阳性T细胞发生相互作用并激活后者，以及这种依赖于单核吞噬细胞的效应T细胞扩增是否发生在肠道固有层中。该方法有助于解答炎症性肠病领域中的关键问题，例如结肠固有层内抗原呈递细胞与效应T细胞之间发生了哪些类型的相互作用。该技术的主要优势在于，它能够用于研究免疫细胞之间的相互作用以及导致炎症性肠病致病性的相关因素。

该方法采用T细胞转移性结肠炎模型，将红色荧光抗原特异性初始CD4 T细胞转移至免疫缺陷型宿主，该宿主的单核细胞表达绿色荧光蛋白。细胞转移后，通过口服灌胃给予表达蓝色荧光抗原的细菌。可在疾病发展的不同阶段，监测宿主肠道固有层中发生的免疫事件。

使用解剖剪纵向切开结肠，并在含有 25 毫升 PBS 的培养皿中冲洗组织，以去除任何碎片和黏液。将结肠切成 5 至 8 毫米大小的片段，并将所得组织片段放入 20 毫升不含钙和镁的 DPBS 中，DPBS 中添加 10 毫摩尔 HEPES 和 5 毫摩尔 EDTA。将装有样品的试管在最大转速下涡旋振荡 30 秒。

然后，在37摄氏度下轻轻振荡孵育10分钟，以去除上皮层。孵育结束后，再次涡旋振荡30秒。随后，弃去含有上皮细胞的上清液。

将组织块转移至含有 20 毫升新鲜 PBS、HEPES 和 EDTA 缓冲液的新离心管中，重复进行孵育，并在孵育前后进行涡旋振荡。第三次重复后，所有上皮细胞均已被去除，上清液变得澄清。用 PBS 轻柔洗涤组织碎片，以去除残留的上皮细胞。

将组织碎片切成 2×2 毫米大小的块状，转移至含有 10 毫升 RPI 培养基的消化液中，该培养基中添加了 0.5 毫克/毫升的 VIII 型胶原酶和 10 单位/毫升的 DNase I。将样品涡旋振荡 30 秒。随后，在 37°C 条件下振荡孵育组织块 30 至 35 分钟，孵育期间每 5 分钟涡旋振荡一次试管。

组织消化完成后，将所得悬液通过70微米细胞滤网过滤至50毫升锥形管中。用PBS洗涤滤网一次，然后通过离心沉淀单细胞悬液。最后，用PBS重悬细胞并离心一次。

然后，通过台盼蓝排斥法确定活细胞数量。产生表达青色荧光蛋白-卵清蛋白融合蛋白的大肠杆菌可在体外激活OT-II细胞的干扰素γ产生，而对照大肠杆菌则不能。

仅表达CFP的大肠杆菌。对饲喂了表达PCFP的卵的转基因绿色荧光蛋白小鼠的结肠组织进行离体三维共聚焦成像，结果显示，在靠近肠上皮细胞的结肠隐窝内存在表达荧光蛋白的细菌，并且这些细菌与宿主肠道吞噬细胞共定位。

在OT-II红色动物中，CD4阳性T细胞的特征是共表达红色荧光蛋白和Vβ5.1。当用大肠杆菌PCFP-OVA攻击时，已过继移植了OT-II红色CD4阳性CD62配体阳性T细胞的BNT淋巴细胞缺陷型绿色荧光蛋白表达转基因小鼠会迅速丧失体重，并出现结肠炎的临床症状。

细胞转移7天后，仅有少数宿主吞噬细胞摄取了大肠杆菌PCFP卵清蛋白，且未检测到OT-II红色阳性细胞。细胞转移14天后，已摄取大肠杆菌

大肠杆菌PCFP卵抗原位于过继转移的OT-II红色阳性细胞附近。细胞转移21天后，大量宿主细胞已摄取大肠杆菌PCFP卵抗原，而供体OT-II红色阳性细胞则分散分布于结肠固有层中，并与宿主肠道吞噬细胞密切接触。

如果操作得当，掌握该技术后可在四小时内完成。在完成该步骤后，可进一步开展其他方法，如肠道淋巴细胞染色和血清细胞因子分析，以探究CD4 T细胞的活化状态，并确认结肠炎的严重程度。随着每一次进展，该技术将为免疫学领域的研究铺平道路，有助于探索在小鼠模型中导致炎症性肠病的细微事件。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离结肠固有层免疫细胞，以用于后续的体外分析。