镧系配合物的制备、纯化及表征：用于磁共振成像对比剂的研究

本实验的总体目标是合成、纯化并表征含镧系元素的配合物，这些配合物可用于标记生物大分子。首先通过将金属起始原料与配体混合，并控制溶液的pH值来实现合成。实验的第二步是通过透析纯化所得的配合物。

接下来，需要验证游离金属的缺失。该实验流程的最后一步是表征与成像相关的配合物性质。最终可获得结果，表明所合成的配合物可通过弛豫活性测量表现出对比剂的行为。

该方法有助于回答成像领域中的关键问题，例如造影剂在结合蛋白质后其水配位数是否发生变化。通常，需要使用该方法的研究人员会面临困难，因为若不能精确控制 pH 值，将导致 LI 在生物教育中失效。透析和活性测定的示范将由 Buda 和 Sashi 完成。

我实验室的研究生首先将一当量的配体溶解于水中，配制成30至265毫摩尔的溶液，以开始使用镧系金属盐进行标记。此处使用的配体为对氨基苄基-DTPA，浓度为73毫摩尔。接下来，通过加入1摩尔的氢氧化铵，将配体溶液的pH值调节至5.5至7之间。

在本视频中，现使用0.2毫升1摩尔的氢氧化铵溶液溶解1至2当量的镧系氯化物，以制备浓度为5至1000毫摩尔的溶液。可使用浓度为111毫摩尔的氯化铕或氯化钆。通常使用过量的金属以推动反应完全进行，从而简化纯化过程。

接下来，在搅拌的同时将每种镧系盐溶液加入到已准备好的配体溶液中。然后通过加入0.2摩尔的氢氧化铵，将所得反应混合物的pH值调节至5.5至7之间。此处共使用0.5毫升的0.2摩尔氢氧化铵溶液来调节pH值。

如果所使用的配体含有对酸敏感的功能基团，请在此步骤中多次调节 pH 值。调节 pH 时务必小心，因为如果溶液变得过于碱性，任何对碱敏感的功能基团（如异硫氰酸酯）将失去活性而无法使用。在偶联过程中，应通过 pH 测量密切监测反应进程。

当 pH 值保持恒定时，反应即已完成。对于不含任何对碱敏感官能团的配体，进行提高 pH 值的后处理也可能有用。开始透析后处理时，需确定一段合适长度的透析管，以容纳样品体积，并额外留出可容纳样品体积 10% 的余量。然后按照制造商的说明将透析管裁剪至该长度。

本视频中使用了截留分子量为100至500道尔顿的透析膜，但如果在甲硫基化之前进行偶联反应，可根据具体情况选用截留分子量更大的透析管。根据制造商的说明，将裁剪好的透析管在室温下用蒸馏水浸泡15分钟。接下来，用蒸馏水填充透析容器作为透析液，此处使用了一个1升的烧杯。

透析液体积应约为样品体积的100倍。现在将透析管的一端折叠两次，并用透析夹夹紧折叠部分。用橡皮筋缠绕夹子末端，以确保透析过程中管口保持封闭。

将先前制备的反应混合物通过0.2微米滤膜过滤。然后将滤液加载到管路的开放端，注意不要撕裂管路。

务必留出足够的空间以便封闭透析管。将透析管剩余的开口端折叠两次，然后用封口夹封闭，并用橡皮筋缠绕封口处。接着，用另一根橡皮筋将一端夹子上的装有空气的玻璃小瓶固定到透析管的一端。

然后将装有沙子的试管连接到另一个夹子上。这些试管可确保透析管保持浸没在透析液中。现在，将完整的透析管放入含有透析液的透析槽中。

在室温下使用磁力搅拌器以低速搅拌透析液。确保搅拌速度保持缓慢，避免溶液产生涡旋。在一天内更换透析液三次。

在本视频中，分别于 2.5、6.5 和 11.5 小时改变透析液。透析过夜持续进行，总时长为 20 至 28 小时。透析完成后，将透析管从透析液中取出，小心打开一端封口，取出样品。

用清水将透析管清洗三次，并将清洗液合并至样品中。最后，在减压条件下除去样品中的水分，可通过冷冻干燥实现。

将样品冷冻后置于冷冻干燥装置上。为检测样品中游离金属的存在，首先通过将1.4毫升乙酸溶解于400毫升水中配制乙酸盐缓冲液，用1摩尔氢氧化铵调节pH至5.8，并加水定容至500毫升。然后将每种配合物0.3毫克溶解于0.3毫升缓冲液中。

现在配制二甲酚橙指示剂，其浓度应为 pH 5.8 缓冲液中 16 微摩尔。将 3 毫升该指示剂溶液加入先前溶解的金属配合物中。通过观察指示剂颜色由黄色变为紫红色来检测游离金属的存在。

如有需要，可通过绘制标准曲线来定量游离金属的含量。如果样品中仍存在游离金属，则应在表征前使用透析或高效液相色谱法进一步纯化。接下来，为测定鸦片样品的水配位数，需制备浓度约为1毫摩尔的该含鸦片配合物的水溶液，再制备相同浓度的重水溶液。

分析前，需将重水溶液蒸发并用重水重新溶解三次，以去除残留的水分；开启荧光分光光度计，将水溶液加入洁净的比色皿中，并将比色皿放入荧光分光光度计内。随后进行激发和发射扫描，分别确定其最大值约为395纳米和595纳米。接下来，使用刚刚确定的激发和发射波长，以及此处显示的参数，进行磷光时间衰减实验。

使用刚刚获得的发光衰减数据，对已制备的重水溶液重复此步骤，绘制强度的自然对数随时间变化的曲线。这些直线的斜率即为衰减速率。在本视频中，使用 Microsoft Excel 2007 从原始数据生成自然对数图。

使用此处所示的由 Hors 及其同事开发的方程中的衰变速率。如果您的配体含有与金属配位的 OH 或 NH 基团，则必须在使用前对该方程进行修正。为确定样品的弛豫测量值，首先在弛豫时间分析仪上选择所需的应用模式，即 T1 或 T2。

此处选择了 T1 设置。接下来，制备一系列含有不同浓度镧系元素配合物的样品，溶剂为常规溶剂。此处使用水作为溶剂，溶液浓度分别为 10、5、2、0.5、1.25、0.625 和 0。

配制毫摩尔浓度的溶液。也可使用其他可混溶的溶剂或缓冲液，但重要的是需以所用溶剂作为空白对照。样品的最终体积需根据所使用的仪器而定。

将样品放入仪器中，静置5分钟，使其与仪器温度平衡；本视频所用仪器的温度为37摄氏度。通过调整软件参数，获得T1或T2的平滑指数曲线，从而确定弛豫时间，单位为秒。对所有样品（包括空白样品）重复此操作。

现在，计算测得的 T1 或 T2 弛豫值的倒数并作图。将这些值相对于镧系元素浓度（单位为毫摩尔）作图，并用一条直线拟合。拟合直线的斜率即为弛豫率，分别对应 T1 和 T2 的 R1 或 R2。

此处展示了介导与纯化的一般方案。该方案描述了甲基化的一般步骤以及选择不同纯化路径的原因。此处我们看到一个典型的发光衰减图，其中衰减的自然对数相对于时间作图，从类似曲线得到的直线斜率可用于水溶液和重水溶液，结合公式一来确定含鸦片配合物的水配位数。

此处展示了一个活力测定的代表性示例，其中拟合直线的斜率即为样品的T₁活力。除了本方案中描述的水配位数和活力表征外，还必须使用常规化学技术对最终产物进行表征。化合物的结构可通过质谱法确定，此处展示了含有钆和含鸦片类配位化合物的代表性质谱图，图中显示了其特征性同位素分布模式。

完成此操作后，还可采用电子顺磁共振波谱、高效液相色谱和元素分析等方法，进一步表征所得到的配合物。观看本视频后，您应能够充分理解如何合成、纯化和表征含镧系元素的配合物，并将其用于标记生物大分子。